[发明专利]一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法

说明书

本发明公开了一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。本方法以蓝色犁头霉为生产菌种，经种子扩大培养后，在发酵液中投入底物RSA，转化生成氢化可的松；转化结束后离心收集菌丝体，再以水为发酵介质投料底物RSA进行发酵转化，以此类推进行多轮静息细胞转化。特别说明的是在静息细胞多轮转化工艺中，转化介质‑水只需做简单的煮沸处理，不需要像培养基灭菌那样高温高压，也不需要做任何PH等方面的调整，既节省了菌种培养步骤，又节约了培养基的制备灭菌所需的物料和动力，并且提高了氢化可的松的转化率和比生产率。

技术领域

本发明属于微生物甾体制药及医药工程领域，具体涉及一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。

背景技术

甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。氢化可的松(Hydrocortisone，简写HC)又称皮质醇，化学名称为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，属肾上腺皮质激素类药，是目前激素类药物中产量最大的品种，具有抗炎、抗过敏等作用，临床上主要应用于替代治疗肾上腺皮质功能减退症。同时因为它对糖代谢有一定影响，也被用于葡萄糖、血糖过多症等疾病的治疗，在生产中还可作为许多甾体皮质激素药物的前体。自60年代微生物法合成糖皮质激素并进入商业化以来，微生物转化已经成为诸多甾体药物或药物中间体合成路线中的关键技术，而氢化可的松的生产是利用微生物的11β-羟基化作用。对于合成甾体糖皮质激素来说，11β-OH是抗炎药物所必需的基团，现有的高级皮质激素药物都具有C11β-羟基。由于甾体C10位、C13位的甲基容易造成C11β-羟基的立体位阻比C11α-羟基大，并致使C11β-羟基化比C11α-羟基化效率低、副产物多，在一定程度上制约着它的大规模应用。为提高产物的转化率，不少科研工作者进行了大量研究，包括第一个阶段诱变育种或发酵工艺的改进，第二个阶段底物转化。

目前国内微生物转化生产HC的11β-羟基化菌种主要是蓝色犁头霉菌，该菌以化合物RSA(化学名为17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)为底物，经脱乙酰化(水解)生成RS(化学名为17α，21-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮)，RS再被C11β-羟化酶系催化生成HC，其反应式如下：

但由于蓝色犁头霉11β-羟化酶的专一性较差，副产物多，且投料浓度较低，HC的收率受到限制。所以有必要对发酵工艺进行开发优化，提高产品的产量质量，并降低人力，物力，动力以及原材料的使用，达到降低成本、提高收益的目的，这对氢化可的松的工业化生产有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和缺点，本发明提供了一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。本发明将原工艺发酵转化结束的菌丝体分离收集，再投入到介质水中，以水为转化介质再次投料底物RSA进行发酵转化，以此步骤类推进行多轮静息细胞转化。本发明操作简单，成本低廉，同时提高产量。

本发明菌丝体多轮转化工艺与原工艺路线对比：

原工艺：斜面菌种制备—发酵菌种培养—底物投料转化—发酵液分离提取(菌丝体废弃)

本发明工艺：斜面菌种制备→发酵菌种培养→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水(n次利用)→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体酶耗尽，发酵结束。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法，包括如下步骤：

(1)在蓝色犁头霉发酵菌液中投入RSA进行发酵转化；

(2)步骤(1)发酵转化结束后分离菌丝体，将分离得到的菌丝体加入到水中，再次加入RSA进行静息细胞转化；