[发明专利]加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用

说明书

本发明公开了加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用。该核酸传感器由探针HP和DTMB组合而成；本发明整合催化杂交组装（CHA）的无酶信号放大技术与DNA四面体分子探针于一体，制备了加速的DNA四面体分子探针，利用空间限域效应，有效的实现了细胞内miRNA的快速成像检测。局部CHA可以有效实现信号放大，同时加快检测速度和检测灵敏度。DNA四面体可以避免细胞内核酸酶的降解作用，降低假阳性信号。本分子探针具有反应迅速，灵敏度高，抗干扰能力强等优点，能够弥补现有miRNA检测方法的不足，实现miRNA的快速准确的检测。

技术领域

本发明涉及加速的DNA四面体分子探针在检测、成像领域中的应用，尤其涉及一种加速的DNA四面体分子探针在活细胞内miRNA检测、成像中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

miRNA作为一种重要的肿瘤标志物，它在细胞中的分布和表达水平与癌症的发生发展有着重要关联。因此，实现细胞内miRNA的原位成像和检测对于肿瘤的早期诊断、预后监测以及相关药物研发具有重要意义。传统的miRNA检测方法包括Northern印迹杂交法，微阵列杂交和实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）等。尽管这些方法的准确性好，但在实际应用中仍存在一些不足。例如Northern印迹和微阵列杂交技术的特异性和灵敏度不高，qRT-PCR方法操作繁琐、引物设计严格且必须依赖精良仪器等，而且目前大多数的检测技术只能用于体外检测，对活细胞内miRNA的原位成像检测仍然存在困难。因此，发展用于活细胞内microRNA原位成像的新型探针具有重要的意义。

本发明将“催化杂交组装”(CHA)无酶信号放大技术与DNA四面体分子探针结合起来，制备了加速的DNA四面体分子探针。CHA可以实现信号放大，提高了待测miRNA的检测灵敏度。DNA四面体可以避免细胞内核酸酶的降解作用，降低假阳性信号。同时，DNA四面体对CHA发卡对的空间限域作用，可以有效的提高CHA反应的速率，缩短检测时间。

发明内容

本发明的目的是提出加速的DNA四面体分子探针在miRNA检测及活细胞成像中的应用。

当待测miRNA存在时，引发DNA四面体探针上的原位CHA放大过程，HP与MB杂交生成双链，FAM与Dabcyl的相对距离变大，荧光恢复，从而以miR-21分子为模型实现了活细胞内miRNA的原位成像。通过相对荧光变化值F与miRNA浓度成正比的关系，实现了对不同浓度的miR-21的定量。

所述加速的DNA四面体分子探针包含：一个DNA发卡结构（HP）和一个修饰有荧光染料的分子探针MB嵌入的DNA四面体（DNA四面体分子探针DTMB）；所述的DNA四面体分子探针DTMB由四条DNA单链S1、S2、S3和S4自组装而成；所述分子探针MB位于单链S1中，组装后位于DTMB的一条棱S1的延伸部分。荧光染料FAM 和Dabcyl分别修饰在MB的茎部两侧对应位置，所述DNA发卡结构HP通过碱基互补连接在靠近MB的顶点。所述HP与MB构成催化杂交组装（CHA）发卡对，在miRNA存在时，HP被miRNA打开后与MB杂交并释放出miRNA。

所述DNA发卡结构HP序列如SEQ ID NO.5所示；所述S1、S2、S3和S4序列如SEQ IDNO.1-4所示。

所述的加速的DNA四面体分子探针的合成步骤如下：

（1）将发卡结构HP预先溶于1xTAE/Mg²⁺缓冲液，其HP终浓度为2μM，95℃加热5分钟后，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其形成稳定的发卡结构HP；

（2）将探针S1、S2、S3和S4等比例溶于1xTAE/Mg²⁺缓冲液中，使得各探针浓度为2μM，95℃加热8分钟，迅速放入冰浴中，维持半小时，使其完全杂交形成DNA四面体分子探针（DTMB）；