[发明专利]一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统

权利要求书

1.一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，包括如下步骤：

(1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建保守靶标序列的反向重复载体；

(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效；

(3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的反向重复载体通过根癌农杆菌转入SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。

2.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(1)构建保守靶标序列的反向重复载体的具体方法为：

对SMV侵染的大豆发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，根据保守靶标序列设计引物对并以cDNA为模板进行PCR扩增并纯化回收PCR产物，与载体pDONR221进行BP反应，转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序；将序列正确的质粒分别与质粒pHellsgate12进行LR反应，反应产物再次转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序正确的质粒即为构建的反向重复载体。

3.根据权利要求2所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，所述大豆品种为NN1138-2。

4.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效的具体方法为：

a、将反向重复载体转入根癌农杆菌，然后将根癌农杆菌接种到LB固体培养基，挑选单克隆接种至LB液体培养基中培养，收集菌体，然后将菌体注入到本氏烟叶片中；

b、同时，SMV分离物侵染的大豆叶片用磷酸缓冲液借助研钵进行研磨，将汁液过滤，即完成病毒病液的准备；

c、将b得到的病毒病液通过机械摩擦接种至a处理后的本氏烟叶片中，接种后用qRT-PCR技术对接种叶中的病毒含量进行检测，筛选出在叶片中病毒的累积量相对值更低的反向重复载体。

5.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(3)中用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆的具体方法为：

种植T1代转基因大豆，当一对真叶完全展开后，剪取一片真叶一分为二，其中半片用于SMV接种，半片用于基因组PCR，将接种SMV后的半片叶至于湿润的培养皿中，待接种后，对其中的病毒含量进行ELISA检测，叶片SMV接种试验结合基因组PCR技术对T1代转基因大豆进行初步筛选。