[发明专利]一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统

说明书

本发明公开了一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，包括如下步骤：(1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建其相应的反向重复载体；(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证各反向重复载体对SMV的功效；(3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的最佳反向重复载体遗传转化进SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种(T1单株“一株两用”)，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。通过本发明的方法，可快速有效、指向性明确的获得对SMV具有广谱抗性的转基因大豆材料。

技术领域

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统。

背景技术

大豆是世界上重要的油料和蛋白作物，在其生长周期中，常常遭受多种病虫害的侵害。大豆花叶病毒(SMV)是一种危害较大的病毒性病害，严重影响大豆产量和品质。为便于研究，基于在不同鉴别寄主上的反应，SMV被人为划分成多种株系，随后SMV株系抗性位点被相应鉴定。然而，聚合多个抗性位点到一个大豆品种中是困难的，常常会导入除抗性位点以外的其它非期望的性状。另外，SMV基因组的突变导致突破宿主抗性的情况时有发生。为了改善SMV抗性育种的困境，获得广谱抗性的大豆品种，基于宿主诱导基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)策略的转基因育种被考虑。

利用HIGS策略结合大豆遗传转化技术成功获得对SMV的广谱抗性关键的第一步是鉴定SMV基因组中的保守片段，然而到目前为止，尚没有研究报道对SMV基因组的保守区域进行系统鉴定。另外，大豆遗传转化技术存在诸多问题，如低效率、耗时、工作量大等问题，这些都阻碍了由SMV保守片段构建的靶标反向重复(target-inverted-repeat,TIR)载体对SMV抗性效果的批量验证。因此需要找到一种快速、有效的对TIR载体功效进行验证的体系，优选对SMV效果最佳的TIR载体。

转基因大豆后代的抗性评估，常常使用转基因材料的T2或T3代对SMV抗性进行评估。然而，由于繁殖转基因种子的过程中，对SMV病毒具有抗性的转基因阳性后代和对SMV不具有抗性的转基因阳性后代都进行了繁殖，这无形增加了大量的工作量。另外，如果对转基因T1代材料直接进行SMV接种来评估其抗性，可能会导致转基因材料的生长受到影响、甚至引起一系列级联反应，进而影响其后代。因此，为了避免上述情况的发生，需要找到一种简单有效的方法对早代转基因大豆材料进行初筛，指向明确的找到潜在的抗SMV的转基因材料。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速获得具有SMV广谱抗性的转基因大豆材料的方法。

本发明的技术方案为：一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，包括如下步骤：

(1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建保守靶标序列的反向重复载体；

(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效；

(3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的反向重复载体通过根癌农杆菌转入SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。

进一步地，步骤(1)构建保守靶标序列的反向重复载体的具体方法为：

对SMV侵染的大豆发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，根据保守靶标序列设计引物对并以cDNA为模板进行PCR扩增并纯化回收PCR产物，与载体pDONR221进行BP反应，转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序；将序列正确的质粒分别与质粒pHellsgate12进行LR反应，反应产物再次转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序正确的质粒即为构建的反向重复载体。