[发明专利]一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种单分子靶标基因建库方法，其特征在于，包括：

延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标靶标探针延伸产物；

第二测序接头连接步骤，包括向延伸步骤所得的反应体系中加入第二测序接头，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至所述靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联有随机核苷酸序列，反应得到第二测序接头连接产物，然后解链处理，去除产物中串联有随机核苷酸序列的单链，得到串联有第一测序接头的单链产物；

双链合成步骤，包括向串联有第一测序接头的单链产物中加入第一引物、第二引物，反应得到可用于上机测序的扩增产物，所述第一引物含有互补配对于所述第一测序接头的序列，所述第二引物含有互补配对于所述第二测序接头的序列。

2.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述模板分子为单链DNA；

和/或，所述模板分子选自双链DNA解链处理后得到的单链DNA、RNA逆转录得到的cDNA中的至少一种；

和/或，所述模板分子来源于亚硫酸氢盐处理的DNA、福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织的DNA、法医样本提取的DNA、体液所含游离DNA(cfDNA)、古生物化石或考古发掘的生物遗存中提取的DNA样本中的至少一种；

和/或，所述模板分子的起始量为0.1至1000纳克；

和/或，所述靶探探针延伸产物为单链DNA。

3.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第二测序接头的正向链的5’端修饰有磷酸基团；

和/或，所述第一测序接头与所述靶标探针之间串联有分子标签；

和/或，所述分子标签的长度为4-19nt。

4.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第二测序接头的反向链的3’端串联的随机核苷酸序列的长度为5-15nt。

5.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，所述第一引物含有可与所述第一测序接头互补配对的序列，所述第二引物含有可与所述第二测序接头互补配对的序列；

和/或，所述第一引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第一测序接头反向互补配对；

和/或，所述第一引物含有或不含有第一样本标签；

和/或，所述第一引物含有第一样本标签时，第一样本标签位于所述内接头序列、外接头序列之间；

和/或，所述第一样本标签的长度为4-15nt；

和/或，所述第二引物含有内接头序列、外接头序列，所述内接头序列的5’端串联连接至所述外接头序列的3’端，所述内接头序列可与所述第二测序接头反向互补配对；

和/或，所述第二引物含有或不含有第二样本标签；

和/或，所述第二引物含有第二样本标签时，所述第二样本标签位于所述内接头序列、外接头序列之间；

和/或，所述第二样本标签的长度为4-15nt；

和/或，延伸步骤中，延伸反应的扩增循环数≥1；

和/或，延伸步骤中，延伸反应的扩增循环数为5-500个循环；

和/或，延伸步骤中，每个循环反应如下：94-98℃，10-60秒；55-65℃，10-60秒；68-72℃，10-60秒。

6.如权利要求1所述的单分子靶标基因建库方法，其特征在于，第二测序接头连接步骤中，连接反应时，具体是在22-40℃下反应0.5-2小时；

和/或，第二测序接头连接步骤中，采用的连接酶为T4 DNA连接酶。