[发明专利]一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒

说明书

一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒，该方法包括：延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标探针混合，靶标探针结合至模板分子的靶标区域并延伸，获得靶标探针延伸产物；第二测序接头连接步骤，包括加入第二测序接头，第二测序接头具有互补配对的正向链、反向链，正向链的5’端可串联连接至靶标探针延伸产物的3’端，反向链的3’端串联有随机序列，反应得到第二测序接头连接产物；解链处理，去除产物中串联有随机序列的单链分子，得到串联有第一测序接头的单链产物；双链合成步骤，包括加入第一引物、第二引物，反应得到扩增产物。本发明将建库与靶向基因富集整合，广泛适用于各种长度和高低起始量的单链或双链DNA样本。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒。

背景技术

现有的下一代测序(NGS)的靶向测序样本制备需要经历建库、捕获前扩增、杂交捕获和捕获后扩增四大步骤，这几部分彼此串联缺一不可，整个流程加起来需要约2到3天时间，不仅费时费钱，而且各个步骤之间的衔接有一定的难度。并且，还需要对起始DNA进行打断前处理，并在建库后做文库片段长度筛选。因此，现有的建库技术难以针对严重降解的样本或者微量DNA样本(一般DNA量低于20ng即难以保证建库质量)。另外，捕获前后的两轮扩增均为指数性扩增，会带来大量错误和偏好性，造成过高的技术错误本底，而导致低频率(低于千分之一)的基因突变检测无法进行。

发明内容

根据第一方面，一种实施例中提供一种单分子靶标基因建库方法，包括：

延伸步骤，包括将模板分子、串联有第一测序接头的靶标靶标探针混合，所述靶标探针靶向结合至模板分子的靶标区域并延伸反应，获得靶标靶标探针延伸产物；

第二测序接头连接步骤，包括向延伸步骤所得的反应体系中加入第二测序接头，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至所述靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联有随机核苷酸序列，反应得到第二测序接头连接产物，然后解链处理，去除产物中串联有随机核苷酸序列的单链，得到串联有第一测序接头的单链产物；

双链合成步骤，包括向串联有第一测序接头的单链产物中加入第一引物、第二引物，反应得到可用于上机测序的扩增产物，所述第一引物含有互补配对于所述第一测序接头的序列，所述第二引物含有互补配对于所述第二测序接头的序列。

根据第二方面，一种实施例中提供采用第一方面所述方法构建得到的文库。

根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，包括第一测序接头、第二测序接头，所述第一测序接头串联连接有靶标探针，所述靶标探针可结合至模板分子的靶靶标区域并延伸反应，所述第二测序接头含有互补配对的正向链、反向链，所述第二测序接头的正向链的5’端可串联连接至靶标探针延伸产物的3’端，所述反向链的3’端串联连接有随机核苷酸序列。

依据上述实施例的单分子靶标基因建库方法及其试剂盒，将建库步骤与靶向基因富集步骤相结合，无需片段化处理，有效缩短建库所需时间，提高建库效率。本方法或试剂盒可适用于各种长度的单链或双链DNA样本，RNA逆转录成的cDNA、亚硫酸氢盐处理的DNA(用于DNA甲基化测序)、各类严重降解的DNA(福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)组织或法医样本提取的DNA、体液所含游离DNA(cfDNA)等)，且起始量适用范围广谱(0.1至1000纳克)。

附图说明

图1为一实施例中的建库流程图；

图2为一实施例中的第二测序接头接头图。

具体实施方式