[发明专利]NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用

权利要求书

1.一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）通过RT-PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；

（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；

（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；

（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；

（5）构建SMN2外显子7中NOVA1靶向结合位点突变以及RNA pull down实验，证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达；

（6）构建小鼠模型：构建lenti-virus NOVA1过表达病毒，皮下注射SMA刚出生小鼠，与Fast Green组进行比较，结果显示：NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。

2.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：

SMA I型对照和I型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后Trizol 法提RNA；RNA逆转录，5×RT Buffer 4μL；dNTP Mix 1μL；Oligo 18 1μL；RNase inhibitor 1μL；Reverse Transcriptase 1μL；RNA 1μg；RNase-free ddH2O to 20 µl；

PCR反应体系，2×Taq master mix 12.5μL；引物E6-F Cy5-ATAAT TCCCC CACCA CCTCC1μL；引物E8-467R TTGCC ACATA CGCCT CACAT AC 1μL；cDNA 1μL；ddH2O 9.5μL to 25µl；

半定量扩增了28个循环；

PCR产物用DdeI酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，Image J图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为FL与剪接转录本总量的百分比。

3.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：

筛选了 HNNRP、 SR 及NOVA家族部分成员共21个基因，检测其在SMA Ⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2× ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5μL，F 0.5μL，R 0.5μL，cDNA 1μL，ddH2O 3μL；反应条件为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 20s，45个循环；60℃ 60s，95℃ 15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。

4.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：

在SMA I型小鼠P1、P4 及 P7 各时间点，提取 RNA 及蛋白后，采用 QPCR 及westernblot 方法分别检测 NOVA1和SMN全长基因及蛋白水平表达变化。

5.根据权利要求1所述的NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（4）的具体步骤为：

在细胞培养6 孔板中，种适量密度的U87MG细胞，并添加 2mL完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到 50%时，分别将 0.5μg NOVA1 过表达质粒或5μL 20μM NOVA1 siRNA与1μg SMN2 minigene加入100μL opti-MEM 中混匀，室温放置 5min；同时，将3μLPEI加入100μLopti-MEM 中吹打混匀，室温放置5min；

将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min；

弃去6孔板中培养基，加800μL无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h 后，用2mL新鲜预热的完全培养基换液；

36~48h后检测SMN2外显子7列入。