[发明专利]NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用

说明书

本发明提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，验证方法包括如下步骤：（1）RT‑PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；（5）证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入；（6）构建小鼠模型，证实NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。本发明证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。

技术领域

本发明属于医学生物化学领域，具体涉及一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用。

背景技术

研究表明SMA是由于第五号染色体上运动神经元生存1（survival of motorneuron 1, SMN1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长SMN蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（inverted duplication）产生了一个SMN1的平行同源基因称作SMN2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的SMN蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由SMN1中的C转变为SMN2中的T（C6T），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了该外显子列入(exon inclusion)。SMN2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作SMN∆7）基本没有功能且极不稳定。SMN2表达的少量全长SMN蛋白虽然不足以补偿SMN1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。

随着生物技术的飞速发展，CRISPR/Cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（Science），频繁报道CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy, DMD）基因治疗的论文，以DMD动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助AAV载体运载基因编辑的CRISPR/Cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的DMD基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现Dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在SMA小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。

基因表达RNA的异常剪接常常导致人类疾病，研究表明，超过60％的人类致病突变影响剪接，与基因突变造成的RNA剪接位点的错误选择有关，而不是直接影响编码序列。所有遗传性疾病中有三分之一可能具有剪接成分。在人类体内表达SMN蛋白有两个基因：SMN1和SMN2，但是起主要作用的SMN1基因突变失去功能后，由于SMN2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量SMN全长基因，少量SMN有功能蛋白，目前最有效的方法是ASO反义寡核苷酸，靶向互补内含子7第10-27序列，比如商业化的Spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子ISS序列，促进外显子7列入比例，但是ASO半衰期较短，必须持续性给药。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，研究证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法，包括如下步骤：

（1）通过RT-PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；

（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；

（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；