[发明专利]用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA基因编辑的gRNA引物及其应用

说明书

本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(LAT‑miRNA)基因编辑的gRNA引物及其应用，通过对比分析不同毒力MDV‑1编码的LAT‑miRNA及其邻近基因组序列，选取该基因簇5’端和3’端两侧高度保守的区域作为gRNA靶点区，设计合成了互补配对的一系列gRNA，并构建pX459‑gRNA表达质粒，将其两两组合后均能引导CRISPR/Cas9系统精准有效地实现MDV‑1超强毒株GX0101整个LAT‑miRNA的精准编辑和敲除。由于LAT‑miRNA在不同毒力MDV‑1毒株之间具有高度的基因座位保守性和序列保守性，因此利用本发明设计的gRNA，可以精准有效地编辑不同MDV‑1毒株的LAT‑miRNA。该实验方法设计简单、gRNA靶向性好，基因编辑及敲除时效高，为研究其致病、致瘤调控机制及新型疫苗研发提供了新的思路和技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种用于马立克病病毒LAT基因簇miRNA(以下简称LAT-miRNA)基因编辑的gRNA引物设计及其应用，属于基因工程技术研究领域。

背景技术

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)是最初在一些细菌和古生菌中发现的一种重要的外援基因，与CRISPR相关蛋白家族(Cas)共同构成自身适应免疫系统的重要组成部分，用以抵御外来质粒和噬菌体的核酸入侵。CRISPR/Cas9系统属于II型CRISPR/Cas系统，该系统只需要一个向导RNA(guide RNA，gRNA)介导即可特异性识别并结合位于靶基因下游的5’-NGG-3’(Protospacer adjacent motif，PAM)序列，从而激发Cas9的双链DNA切割功能，产生一个双链的切口(Double strandbreak，DSB)，而细胞基因组DNA利用其自我修复功能，由易出错的非同源末端连接(Nonhomologous end-joining，NHEJ)和同源定向修复(Homology-directed repair，DHR)的方式修复DSB切口，最终实现靶点DNA的插入和/或缺失(Insertion-deletion，InDel)。由于Cas9这种核酸酶的可控性和通过修改gRNA靶点就能轻易改变Cas9切割位点的便捷性，基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑技术在短短数年时间得到了迅速开发和利用。目前，科学家们已将这一技术广泛应用于许多物种活细胞基因组DNA及核苷酸序列编辑，如人类细胞、细菌、斑马鱼、酵母、小鼠、果蝇和蛔虫等。随后，CRISPR/Cas9基因编辑技术对病毒基因组尤其是大基因组DNA病毒的编辑也相继报道，且主要集中在一些致瘤性疱疹病毒。

马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于甲亚科疱疹病毒，是少数几种在其自然宿主中可诱导产生肿瘤的一种致瘤性疱疹病毒。根据致病性不同可以将其分为3种血清型：MDV-1、MDV-2和MDV-3，其中只有MDV-1具有致病性和致瘤性。MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb，编码100多个病毒基因。近年来，随着高通量测序技术的发展及应用，科学家们研究发现在MDV基因组中还存在着大量病毒微小RNA(microRNA，miRNA)基因的表达，并且这些病毒编码的miRNA与MDV的致病性及致瘤性密切相关。MDV-1共编码14个miRNA前体(Precursor miRNA，pre-miRNA)，可剪切加工产生26个成熟体miRNA分子，他们全部位于病毒基因组的反转重复序列区中，形成3个明显的miRNA基因簇，分别被命名为Meq、Mid和LAT基因簇。其中LAT基因簇由miR-M6、miR-M7、miR-M8、miR-M10和miR-M13组成，这些miRNA主要位于IR_S/TR_S重复序列与病毒潜伏感染相关基因转录物(Latency-associatedtranscript，LAT)的第一个内含子中，与病毒潜伏感染密切相关。

发明内容