[发明专利]一种角膜内皮细胞的分离培养方法在审
| 申请号： | 202011537052.4 | 申请日： | 2020-12-23 |
| 公开（公告）号： | CN112522179A | 公开（公告）日： | 2021-03-19 |
| 发明（设计）人： | 张俊克;冷晓燕 | 申请（专利权）人： | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京睿智保诚专利代理事务所(普通合伙) 11732 | 代理人： | 周新楣 |
| 地址： | 214128 江苏省无锡市新*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 角膜 内皮 细胞 分离 培养 方法 | ||
1.一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)用胶原酶A和Liberase酶的混合酶对角膜进行消化，然后分离得到角膜内皮层；
(2)将所述角膜内皮层接种到增殖培养基中，形成原代细胞，待原代细胞融合达到80％以上时，进行传代培养；
(3)当最后一次传代培养的细胞培养至细胞融合达到80％以上，将增殖培养基更换为维持培养基，培养7～10d，获得角膜内皮细胞。
2.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜的直径为1～3mm。
3.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述角膜与混合酶的消化比例为1个:150～250微升。
4.如权利要求1或3所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述胶原酶A的浓度为1.5～2.5mg/mL，所述Liberase酶的浓度为0.4～0.6mg/mL；所述混合酶中胶原酶A和Liberase酶的体积比为10:1～1:1。
5.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述消化的条件为：36～37℃消化20～40min。
6.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述角膜内皮层与增殖培养基的接种量为1个:0.8～1.2mL。
7.如权利要求1所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的方法为：将消化的原代细胞接种到增殖培养基中进行第一次传代培养，待第一次传代培养的细胞融合达到80％以上时，消化后进行第二次传代培养，以此类推至传代培养结束。
8.如权利要求1或7所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的细胞接种密度为4500～5500个/cm2。
9.如权利要求1或7所述的一种角膜内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，所述传代培养的次数为2～4次。
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