[发明专利]一种角膜内皮细胞的分离培养方法

说明书

本发明属于细胞的分离培养领域，本发明提供了一种角膜内皮细胞的分离培养方法。本发明提供的角膜内皮细胞的分离培养方法，采用胶原酶A和Liberase酶的混合酶对角膜进行消化，之后采用物理的方法分离角膜内皮层，以分离的角膜内皮层细胞为种子细胞进行原代培养和传代培养，获得角膜内皮细胞。该方法获得的角膜内皮细胞纯度较高，形态典型，未出现间质化现象，且细胞扩增能力强，细胞产量高。

技术领域

本发明涉及细胞的分离培养的技术领域，尤其涉及一种角膜内皮细胞的分离培养方法。

背景技术

角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CECs)是位于角膜后表面的单层细胞，它通过物理屏障作用和主动液泵功能对维持角膜的半脱水状态、正常厚度及透明性起着关键性作用。然而人源角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells,HCECs)属于终末细胞，在体内条件下仅具有极为有限的增殖能力。当HCECs数量受到年龄、疾病、眼内手术等因素的影响下降到其生理临界值以下时，便可导致角膜水肿，发生角膜盲。角膜盲是导致失明的第二大原因，仅次于白内障，角膜移植术是目前让角膜盲患者复明的唯一手术方式。尽管目前角膜移植手术技术已非常成熟，但由于供体角膜匮乏，仅1.3％患者可以得到有效治疗，且每年只有约5000例患者能够通过角膜移植来恢复视力或保留眼球，供体角膜不足限制了角膜内皮层移植的开展。因此，为满足广大患者的需求，亟需解决供体来源匮乏的问题，组织工程化角膜内皮细胞以及新型角膜内皮细胞注射液药物为解决眼科发展面临的问题提供了丰富的材料来源和崭新的解决思路。

体外培养HCECs首先要提取种子细胞，即角膜内皮细胞。目前从角膜中获取角膜内皮细胞的方法主要包括机械刮除法、组织贴块法、揭膜法、揭膜-消化两步法。最常用的方法是揭膜-消化两步法，即在显微镜下从角膜周边到中央部完整撕除后弹力层和角膜内皮层，然后利用胶原酶A、DispaseⅡ等进行消化，在显微镜下观察到细胞变圆、间隙变大时加入血清终止消化，经过漂洗、离心后获得种子细胞进行接种培养。该法优点是效率较高，缺点是揭膜时需要熟练的操作技巧，且可能会有角膜基质细胞混入。但是该方法针对的是正常直径大小，厚度适宜、粘连不是太紧的角膜组织，而对于那些直径较小，特别薄或粘连很紧的样本，则后弹力层很难揭下，甚至可能出现部分撕裂，因此难以采用揭膜-消化两步法。目前针对这些样本只能采用组织贴块法，但是该方式获得的细胞纯度较差，容易有其他细胞污染，除此之外尚无更好的分离方式分离这些样本。

目前对于正常角膜组织常用的角膜内皮细胞消化酶有胶原酶A(Collagenase)和DispaseⅡ。胶原酶A通过水解细胞间质的脯氨酸，从而使细胞离散。胶原酶A对胶原的消化作用很强，它仅对细胞间质有消化作用而对细胞损害不大，因此适于消化分离纤维性组织和较硬的癌组织。钙镁离子和血清不会对胶原酶A的活性及消化作用产生影响。DispaseⅡ，中文名称为中性蛋白酶，又称分散酶，是一种非特异性的金属蛋白酶，被用来从各种不同组织或器官中消化细胞外基质，释放并制备原代单细胞；或用于细胞培养中的细胞收获或接种转移；也被用于防止悬浮细胞培养时的细胞意外结团。此外有文献报道Liberase酶对组织也有很好的分离效果，其是一系列高度纯化酶的混合物，可提高组织解离的质量和可重复性，并提高分离细胞的活力和功能性，但是并没有报道Liberase酶消化角膜组织的应用和方法。这些酶虽然对正常角膜组织或非角膜组织都有很好的消化分离效果，但是在消化那些直径较小、厚度薄、粘连很紧的特殊角膜样本时，却没有取得较好的效果。申请人通过试验发现：胶原酶A处理特殊角膜样本时，会同时消化掉基质层，造成基质污染；DispaseⅡ酶处理时根本不能对角膜内皮层进行分离；Liberase酶虽然不会造成基质污染，但是难以分离。

发明内容

针对上述提到的特殊角膜样本，本发明提供了一种的角膜内皮细胞的分离培养方法。该方法采用混合酶对角膜进行消化，之后采用物理的方法分离角膜内皮层，以分离的角膜内皮层细胞为种子细胞进行原代培养和传代培养，获得角膜内皮细胞。具体技术方案如下：

本发明提供了一种角膜内皮细胞的分离培养方法，包括如下步骤：