[发明专利]一种糖基转移酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种糖基转移酶突变体及其应用，该突变体由葛根糖基转移酶氨基酸序列的第196位苯丙氨酸突变为酪氨酸得到。本发明在同源建模和序列比对的基础上，采用定点饱和突变技术对糖基转移酶进行分子改造，筛选获得高酶活的糖基转移酶突变体F196Y和该突变体的工程菌，均可用于催化大豆素与UDPG缩合生成葛根素，活力是野生型的2倍以上。此外，本发明还公开了F196Y及其工程菌与UDPG再生系统在葛根素合成中的应用，解决了辅酶UDPG原料来源问题，更有利于实现工业化生产，显著提高了该糖基转移酶在葛根素生物合成方面的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体地说，是涉及一种糖基转移酶突变体及其应用，尤其是该突变体在催化大豆素与UDPG缩合合成葛根素的应用。

背景技术

葛根素(Puerarin)是传统中药葛根的主要活性成分，具有显著的多样化生理活性，包括血管舒张、心肌保护、缺血再灌注损伤保护、治疗糖尿病及其并发症、抗炎活性、抗氧化损伤、雌激素样作用、抗肿瘤活性等。临床上，主要用于治疗冠心病心绞痛、心律失常、高血压、心力衰竭、心肌梗死等病症。葛根素为异黄酮类化合物，具有4,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮结构，水溶性差，口服生物利用度低，因此，临床上主要应用其注射液。

葛根素具有8位碳苷糖基结构，化学合成困难，目前其单体化合物主要由豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.))的根，经提取分离获得。植物成分极为复杂，即使通过精细的提纯，仍有痕量的杂质残留，容易导致不良反应的发生。采用酶催化法合成葛根素，可改变葛根素的来源，控制杂质残留，极有可能解决其不良反应问题，为其临床应用提供安全保障。目前来源于野葛的糖基转移酶 PIUGT43是唯一功能确定的异黄酮碳苷糖基化转移酶《Molecular characterization of the C-glucosylation for puerarin biosynthesisin Pueraria lobate(葛根中葛根素生物合成中C-糖基化的分子表征)》(The PlantJournal,2017,90,535-546)，但野生型PIUGT43的催化效率较低，工业化大生产困难。

经检索发现，定点突变用于C-糖基转移酶的技术方案已有报道。

《美达霉素生物合成中糖基转移酶Med-ORF8定点突变及功能分析》(华中师范大学，2010)利用ClustalW(http：//align.genome.jp/)在线对三种糖基转移酶 (即C-、O-及N-糖基转移酶)氨基酸序列进行多序列比对，初步确定将Med-ORF8 的I307(异亮氨酸)突变为D307(天冬氨酸)。将点突变的糖基转移酶基因 med-ORF8*插入原核表达载体pET-28a的NdeI和HindⅢ之间构建了原核表达质粒pHSL74-6，并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得原核表达工程菌株。通过原生质体转化将pHSL73-2转化到med-ORF8基因缺失的基因簇异源表达系统中。但该技术方案用于美达霉素，且用于次级代谢产物生产，不涉及体外酶活。

《一种酶法制备莱鲍迪苷E的方法》(CN201910095404.6)UDP(尿苷二磷酸)糖基转移酶催化底物为甜菊苷，突变位点为358。经定点突变筛选有益突变体后，突变体N358F催化甜菊甙生产莱鲍迪苷E，甜菊甙转化率为94％，莱鲍迪苷E的产率大大提升至87％。有益突变提高了UDP-糖基转移酶活，从而提高了催化甜菊苷获得莱鲍迪苷E的效率。由此可见，不同突变点位对次级代谢产物生产、对应功效，都具有不同的效果。