[发明专利]一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。该扩增体系包括组分1和组分2；组分1包括灭活的基因工程细胞1、胎牛血清IL‑2和淋巴细胞基础培养基；组分2为含灭活的基因工程细胞2的淋巴细胞基础培养基；基因工程细胞1为表达CD80、IL21、IL12的滋养细胞；基因工程细胞2为表达CD80、IL12的滋养细胞。本发明利用该扩增体系与NK细胞共培养，14天获得的NK细胞的存活率达92％，NK细胞扩增倍数约5000倍，达到各种临床适合治疗病症预期疗效应用要求；同时可以有效降低NK细胞的应用成本，为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。

背景技术

NK细胞(自然杀伤细胞，Natural Killer Cell)行使着连接获得性免疫和固有免疫桥梁的作用。一方面，当机体发生感染及创伤时，NK细胞以防御者的身份通过非肽-MHC的识别方式快速，广泛，特异地识别抗原，及时地清除病原微生物，变异细胞，发挥固有免疫的作用。另一方面NK细胞被认为也部分参与了适应性免疫应答，能够影响αβT细胞和B细胞的效应功能。

在肿瘤的发生发展过程中，NK细胞既可以通过活化性受体直接识别肿瘤细胞并被活化，也可以被辅助细胞(单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞等)活化。这些辅助细胞通过其模式识别受体来应答内外环境的变化，再通过分泌多种可溶性因子或直接接触的方式将信号传导给NK细胞。在人类，已经证实存在的可溶性因子有IL12，IL-18，typeI IFN,TNF-α等；直接接触的分子有GITRL/GITR,CD48/2B4，MICA or MICB or ULBP1-ULBP3/NKG2D,AICL/NKp80等。基于以上原理在体外扩增活化的NK细胞对肿瘤细胞显示出良好的杀伤活性，并应用于肿瘤生物治疗中。

目前制约NK细胞的临床应用的主要障碍之一就是难以得到足够数量的NK细胞。如何在体外实现NK细胞大规模扩增是目前NK细胞治疗的关键问题。外周血中NK细胞仅占很小的部分。而肿瘤病人的外周血中往往NK细胞的数量和活性有明显的下降。不同人NK细胞的性质有很大差异。寻找高效的个性化的NK细胞大规模扩增方法对NK细胞的临床应用有重大意义。

近年，人工抗原提呈细胞(使用基因工程技术制作的滋养层细胞)越来越多的用于NK细胞的体外扩增。比如把膜结合IL15和4-1BBL导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞在21天平均扩增277倍。把MICA和4-1BBL导入K562细胞，并加以IL15刺激NK细胞可在24天平均扩增550倍。把mIL21，4-1BBL，CD64，CD86，tCD19导入K562细胞，这种方法得到的人工抗原提呈细胞可以将NK细胞3周平均扩增一万倍以上。CN103484429A公开了一种NK细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。该发明将NCR3LG1和m IL-15同时转染到K562细胞，mIL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。再加上游离添加的IL-2和IL-21等因子的刺激，可以在21天的培养时间内，使PBMC细胞数量得到超过500倍的增殖，CD3-CD56+NK细胞的比例超过70％。

另外，免疫细胞有自然的生命周期，但受到细胞因子等活化会改变这个周期。被过度活化的免疫细胞容易发生细胞死亡。免疫细胞过早死亡一方面影响了扩增效率，另一方面死亡细胞可能会影响活的免疫细胞的增殖和活性，导致NK细胞用于临床治疗的安全性下降。因此，在NK细胞的扩增倍数达到临床应用需求的同时需要更加重视细胞存活率的提高。然而，目前现有技术培养的NK细胞存活率不够理想。因此，提供一种NK细胞存活率和扩增倍数均较高的培养体系保证生物治疗的安全性具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种淋巴细胞的扩增体系及扩增方法。本发明扩增体系可明显提高NK细胞的存活率和扩增倍数。