[发明专利]一种扩增NK细胞的培养体系及其培养方法

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种扩增NK细胞的培养体系及培养方法。本发明培养体系培养14天获得的细胞中NK细胞纯度达92.19％，NK细胞扩增倍数达6100倍，且肿瘤杀伤活性不降低。为NK细胞过继免疫治疗的广谱应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及细胞技术领域，尤其涉及一种扩增NK细胞的培养体系及其培养方法。

背景技术

NK细胞是目前已知的杀死发生肿瘤免疫编辑的肿瘤细胞的最主要的免疫细胞，是临床上进行肿瘤细胞免疫治疗的重要手段之一，临床研究表明，异体和自体的NK细胞免疫治疗是安全的。2009年卫生部就曾发布《自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术管理规范(征求意见稿)》，把NK细胞免疫治疗技术作为第三类医疗新技术列入了临床治疗的应用范围。但十年来，NK细胞治疗技术并没有在医院得到广泛的应用，在前期的一些临床试验中，自体NK细胞疗法临床应用的疗效并不明显,其中根本原因是，无法得到足够数量和活性的NK免疫细胞影响了NK细胞的治疗效果，可以想象，在肿瘤负荷较大的患者，如果回输的NK细胞90％的以上处于沉默状态，而不是激活状态，那它对肿瘤细胞肯定不能有很好的杀伤作用，另外根据体外试验证明当NK细胞与肿瘤细胞在效靶比为10:1时，杀伤效率可达到80％以上，但是如果回输的NK细胞量远远小于体内的肿瘤细胞量，这个治疗效果就会减弱。因此，如何在体外实现NK细胞大规模扩增培养是目前NK细胞治疗的关键问题。

体外大规模扩增NK细胞的两种常用方法：

1、滋养细胞(K562细胞)刺激法

以基因工程手段构建滋养细胞，如CD8α-CD137-K562、4-1BBL-K562等，利用这种方法得到NK细胞纯度较高、倍数也较大，但是由于(1)涉及基因转染，成本和步骤较为复杂；(2)需要用到K562细胞(一种肿瘤细胞)，使用者对其安全有一定的顾虑；(3)在NK细胞或者CAR-NK细胞进行药品注册的时候，需要对其进行安全性评价，滋养细胞为一个完整的细胞，涉及到的评价内容会非常复杂，极大的增加了安评的难度和支出。

2、因子刺激方法

传统的NK细胞体外扩增方法，利用一些细胞因子或者因子组合在体外刺激PBMC或者纯化的NK细胞，利用该方法得到的NK细胞一般纯度不高(NK细胞纯度不高意味着，其它杂细胞的含量高，比如T细胞，而T细胞为特异性细胞，如果回输进入人体，容易产生GVHD反应)，倍数也不大(倍数不高意味着终产品中NK细胞的数量少，而数量少就不能达到治疗或者杀伤靶细胞的目的)，也有极端一些的可以得到极高纯度的效应细胞，但是扩增倍数极低，即便延长培养时间也无法达到临床所需的数量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种扩增NK细胞的培养体系及培养方法。本发明培养体系可明显提高NK细胞的纯度和扩增倍数，且获得的NK细胞对肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种扩增NK细胞的培养体系，包括NK细胞无血清培养基、组分1、组分2和组分3；

所述NK细胞无血清培养基为含白蛋白和抗生素的NK细胞基础培养基；

所述组分1包括基质、CD14、CD19、CD86和CD137L；

所述组分2包括基质、IL12、IL15和IL21；

所述组分3包括基质、IL2和3,4,5-三羟基苯甲酸。

一些实施方案中，所述NK细胞无血清培养基为含1～9％v/v白蛋白和20～100U/ml抗生素的NK细胞基础培养基；

所述组分1包括基质和摩尔比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(1.2～2.4)的CD14、CD19、CD86和CD137L；