[发明专利]一种新型基因编辑工具的设计及其使用方法

说明书

本专利中的基因组编辑工具由一种RTgRNA分子和基因编辑融合蛋白结合而成。融合蛋白主是由一种改造过的Cas蛋白和改造过的逆转录酶连接而成。本专利的基因编辑器能在人类细胞基因组上的指定区域改变DNA。改变DNA的方式包括短片段删除、增加、替换DNA碱基。本专利的基因组编辑工具拥有超高精准性，拓展性强，能实现多种编辑，设计较为容易，成本较低，能多位点同时编辑的特点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域的基因组编辑技术一类，具体涉及一种基因组修改工具的构建、制备方法。本基因组修改工具可以在一种特殊设计的RTgRNA的指导下，定位到人类基因组上指定靶点，进行DNA的插入，删除，多碱基突变。

背景技术

本专利的基因编辑器是能和碱基编辑器对标的人类基因组超精准编辑器。首先，这种编辑器可以做12种碱基对的转换，碱基编辑器只能做4种碱基对的改变。第二，碱基编辑器不能插入或者删除人为设计的小片段DNA(大约1～100bp)到指定的编辑位点，然而本专利的技术可以做到。

第三，专利中的基因组编辑器根据专利中所述的方法，可以实现人类细胞多位点，超精准，在打靶区域内，一个或多个碱基的转换，或者多个位点的删除和插入。为了方便理解，可以表达多位点不定量任意碱基转换(Multiplexing single-or-more arbitrarybase conversion,MSMABC for short)，简称MSMABC。以及多位点短片段DNA插入或删除(Multiplexing short insertion-or-deletion，MSI for short)，简称MSID。碱基编辑器从原理上来说可以做到多个不同位点的碱基转换，但做不到在多个打靶区任意碱基同时替换。碱基编辑器也没办法做到在打靶区做短片段DNA的插入和删除，更不用说多靶点短片段的DNA的插入和删除了。HDR介导的相关编辑，操作起来很麻烦，而且实际效率很低。所以就MSMABC和MSID的能力来说，理论上，本专利中的编辑器代表了编辑人类细胞基因组工具的最高水平。目前通过文献检索，全球范围内没有单位将本专利中所用的改造过的逆转录酶和改造过的AsCpf1蛋白组合在一起形成融合蛋白来实施基因组编辑的。

发明内容

定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸和蛋白质化学、分子生物学、细胞学，相关术语和实验室操作步骤均为相应领域广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的分子克隆技术和DNA重组技术是本领域技术人员熟知的。

“纳米粒子递送”包括脂质体转染(lipofection)，二乙氨乙基葡聚糖转化法(Diethylaminoethyl-dextran，DEAE for short)，磷酸钙转染法(calcium phosphate)。本专利优选使用脂质体转染的方法展示所有实施例。

“突变”，指的是单个或多个碱基突变，也包括基因编辑区域内单个连续或多个不连续的碱基插入和删除。除非本专利特指，突变指的都是在特定语境下广义的突变，包含突变的三种形式，即一个或多个碱基突变，一个或多个碱基删除，一个或多个碱基插入。

“基因组编辑”在本专利特指点突变，或者插入，或者删除基因组上的DNA序列。基因组编辑可以是同时或连续多点突变、多位点插入、多位点删除基因组上的DNA序列。