[发明专利]一种中药肉桂冷冻切片的制作方法

说明书

本发明提供了中药肉桂冷冻切片的制作方法，其包括如下步骤：材料前处理：将中药肉桂样品浸泡在含70％乙醇与水按照体积比为1～2：1的溶液中1～2小时；取出，切制成长5～8mm，宽5～8mm的短段；再将所述短段样品浸泡2～3小时，取出，擦干，并放入装有水合氯醛试液的试管中，加热至沸腾5～7次；然后取出样品，擦干；样品包埋，冷冻固定；冷冻切片；展片与制片。该方法不易使组织结构变形、切片时样品不易破碎；无需染色；可快速获得结构完整的中药肉桂冷冻切片；切片组织结构清晰、细胞内含物保留完整；制作周期短，4～6个小时内即可完成从前处理至显微观察拍照，既而获得完整图像的整个过程；对中药肉桂的鉴定、扩大肉桂应用范围及相关标准的制定有重要的意义。

技术领域

本发明涉及显微组织切片技术领域，尤其一种中药肉桂冷冻切片的制作方法。

背景技术

中药肉桂是樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥树皮。其性大热，具有补火助阳，引火归元，散寒止痛，温通经络的功效^[1]。肉桂为药食两用之品，其相关产品涉及了医药、食品、日用品、农药等多个领域，使用范围广，用量大，是国际上重要的药用植物品种^[2]。

因肉桂与伪品柴桂皆为樟科樟属植物，性状气味相似，易造成混淆^[3-4]。且柴桂主要用于治疗寒湿痹痛、脘腹痛、痛经、跌打损伤等，故不能同肉桂混用^[4]。又因两者化学成分相近，薄层鉴别无法区分。后采用组织切片及粉末显微鉴别，发现柴桂与肉桂有明显的差别^[5]。可见，肉桂及其混伪品的鉴别以显微鉴别更有效且准确。

目前，中药横(纵)切面的显微鉴别所用切片大多采用徒手切片或者石蜡切片两种切片方法制备。徒手切片法是指手持刀片将实验材料切成薄片的制作方法，由于样品难以固定，在切片时易产生厚薄不匀现象，难以获得完整且组织结构清晰的切片。且徒手切片法受材料质地影响极大，在一定程度上，亦受人员徒手切片经验、能力的限制。石蜡切片法虽是最常用的方法，但由于材料切片前需经过固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，耗时长，过程繁琐，细胞内含物流失严重难以观察到，染色方法繁琐多样，且材料容易变形。

目前肉桂解剖结构的研究主要是通过制作树皮石蜡切片，然后在显微镜下观察其结构特征，但石蜡切片制作需要40个小时或更长时间，极其耗时；且因肉桂树皮质地硬而脆，易折断，在制作过程中易碎裂成粉状，难以得到具有完整显微结构特征的切片。宗希明^[6]等开发的肉桂简易制片法虽然将时间缩短到24小时左右，但对材料的选择很苛刻，可观察到的样品范围较小。目前，采用冷冻切片法制作肉桂树皮冷冻切片进行结构及内含物显微观察的研究尚未开展。

中国发明专利(CN 103776657 A)中公开了一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，即采用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，但由于：1)叶片质地及细胞组织构造与树皮完全不同；2)且该专利实施的样品为新鲜叶片，而中药肉桂为干燥树皮，厚0.2～0.8cm，外表面略粗糙，有不规则的细皱纹和横向突起的皮孔；内表面略平坦，有细纵纹，质硬而脆，易折断，断面不平坦；且细胞及组织间构造处于极度干燥的状态，没有适当的前处理方法是无法进行切制的。因此，该发明专利提供的叶片冷冻切片制作方法并不适用于中药肉桂的冷冻切片。

因此，根据中药肉桂的性状特征及质地，亟待建立一种简单、快速、实用的切片方法，有效的完成中药肉桂种质研究、真伪鉴别及相关质量标准的制定。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2020:142-143.

[2]焦少珍.世界桂皮生产、消费和贸易格局分析[J].世界农业,2016(08):124-129.

[3]庞运同,董元玉.肉桂及其伪品的鉴别[J].中国医院药学杂志,2004(12):66-67.