[发明专利]一种副溶血性弧菌检测方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：配置不同浓度的副溶血性弧菌悬浮液，检测每个浓度的副溶血性弧菌悬浮液对应的特征值Y，将这些值进行拟合得到浓度计算公式：Y＝0.2+0.1×LgX，X为副溶血性弧菌的浓度；

S2：取待测副溶血性弧菌悬浮液，检测其对应的特征值Y，根据浓度计算公式：Y＝0.2+0.1×LgX，计算出待测副溶血性弧菌悬浮液的浓度；

所述检测某个浓度的副溶血性弧菌悬浮液对应的特征值Y的方法包括以下步骤：

M1：将第一工作电极、第一对电极、第一参比电极组成第一电化学传感器阵列，将第二工作电极、第二对电极、第二参比电极组成第二电化学传感器阵列，第一工作电极上未培育副溶血性弧菌抗原，第二工作电极上培育有副溶血性弧菌抗原；

M2：采用同样方法对该浓度的副溶血性弧菌悬浮液进行m次检测，每次检测的检测步骤如下：

在未使用过的第一工作电极、未使用过的第二工作电极上都滴加2.5μl该浓度的副溶血性弧菌悬浮液，静置30分钟后，将第一电化学传感器阵列、第二电化学传感器阵列分别插入两个同样的缓冲溶液内并采用循环伏安法从小到大依次切换n种不同的扫描速率进行检测，得到n个还原峰电流差值ΔIp_i1、ΔIp_i2…ΔIp_in，ΔIp_in＝Ip1_in-Ip2_in，ΔIp_in为第i次检测中第n种扫描速率下的还原峰电流差值，Ip1_in为第i次检测中第n种扫描速率下第一电化学传感器阵列对应的还原峰电流值，Ip2_in为第i次检测中第n种扫描速率下第二电化学传感器阵列对应的还原峰电流值，1≤i≤m；

M3：根据m次检测的检测数据构建出特征矩阵D，

M4：将特征矩阵D的每行数据进行二次样条插值，得到m个与每行数据对应的曲线x(t)，对m个曲线x(t)进行同样的数据处理，得到m个特征值F，对每个曲线x(t)进行的数据处理包括以下步骤：将x(t)带入非线性定向饱和共振模型

中，平缓反馈级联稳态势函数：

检测信号载入分量ing(t)＝cos(kt+η)+x(t)，

其中，t为插值变量，k为实参数，η为实参数，nois(t)为功率谱密度函数不平坦的有色噪声，P为实参数，Q为实参数，a、b、c为实数，δ为平缓延时参数，

调节t的值，非线性定向饱和共振模型在t＝t_r点位达到共振，计算共振状态的特征值F：

M5：将m个特征值F取平均，得到的平均值即为特征值Y的值；第二工作电极上培育副溶血性弧菌抗原的方法如下：

N1：将银浆SL和海藻酸钠SA按照质量比1∶3比例混合制成10ml溶胶水溶液，接着超声分散15min，称取5mg的氧化石墨烯GO和1mg的氨基功能化的有机金属框架材料NH₂-CuBTC溶解于溶胶水溶液中，超声震荡25min，得到GO/NH₂-CuBTC/SL/SA混合液，取1.5μL的GO/NH₂-CuBTC/SL/SA混合液滴加到第二工作电极表面，于室温干燥5h，在第二工作电极上形成一层GO/NH₂-CuBTC/SL/SA薄膜；

N2：用PBS缓冲液将副溶血性弧菌多克隆抗体溶液稀释300倍后取4μl修饰在干燥后的第二工作电极上，在干燥皿中静置干燥；

N3：取3.5μl副溶血性弧菌抗原溶液滴涂在第二工作电极上，在30℃条件下培育25min，用蒸馏水洗掉第二工作电极上未结合的副溶血性弧菌抗原，晾干；

所述副溶血性弧菌抗原溶液的制备方法如下：将浓度为2×10⁸cfu/ml～2×10⁹cfu/ml的副溶血性弧菌用8％～12％的福尔马林在25℃～39℃灭活，灭活后离心去除福尔马林，涂布平板进行无菌检验，确定无菌后，沉淀用等体积无菌生理盐水重新悬浮，从而得到副溶血性弧菌抗原溶液；

所述副溶血性弧菌多克隆抗体溶液的制备方法如下：

兔饲养2周后，耳静脉采血15ml，取出血清作为阴性血清样品；副溶血性弧菌抗原免疫兔，间隔3天进行第二次免疫，再间隔6天加强免疫，加强免疫后第4天颈动脉一次性采血，室温放置45min，转入4℃过夜，次日4℃、5000rpm离心45min得抗血清保存；

将1.5ml亲和层析柱固定于蛋白纯化仪上，用去离子水洗出保护剂溶液，接着用PBS缓冲液平衡柱子，然后将1.5ml抗血清样品上柱，用PBS缓冲液洗脱杂质，最后用柠檬酸缓冲液洗脱副溶血性弧菌多克隆抗体，得到副溶血性弧菌多克隆抗体溶液。