[发明专利]编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用

权利要求书

1.一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的5’端为编码Trx肽段的基因序列，其3’端为编码hPTH(1-34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1-34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列全长为599个碱基，其核苷酸序列为SEQ INNO：3。

2.根据权利要求1所述的一种编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列的的5’端引入限制内切酶Nco I位点，在其3’端引入限制内切酶Xho I位点。

3.一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒为pET28b-Trx-hPTH(1-34)，由编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列和表达质粒pET28b(+)DNA分别经限制酶Nco I和Xho I酶切再经DNA连接酶连接形成。

4.一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国，北京市，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC21219，保藏时间为2020年11月23日。

5.根据权利要求4所述的一种表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌，其特征在于，所述表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌为通过将含有权利要求3所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的重组表达质粒pET28b-Trx-hPTH(1-34)纯化后转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，经过卡那霉素筛选和IPTG诱导表达得到。

6.一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、种子活化

将低温保存的权利要求4或5所述的表达Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的工程菌解冻，分区划线接种到含卡那霉素的LB固体平板上，置于培养箱中培养过夜；

2)、一级种子制备

从LB固体平板上挑取若干个单个菌落接种到LB液体培养基中振荡培养3-5h，测定OD₆₀₀在0.5-2时，得到一级种子；

3)二级种子制备

将一级种子液按1:10-100的体积比接种到新鲜液体LB培养基中，于30-37℃、200rpm转速下培养4-8h至OD₆₀₀值达到2.5-3.0，获得二级种子；

4)发酵培养

接种二级种子液至发酵培养基中进行发酵培养，通过调节发酵温度、搅拌速度、通气流量和罐压控制发酵罐内DO30％，发酵体系的pH为6.9-7.1；

5)补料

当发酵罐内溶解氧快速上升至50-70％时开始流加补料，补料液总体积为发酵培养基的1/10；

6)诱导

当OD₆₀₀值达到10-15时，加入无菌IPTG至终浓度为0.3-0.6mM进行诱导，再次加入无菌IPTG至终浓度为0.4-0.7mM进行第二次诱导，2h-5h后结束发酵；

7)菌体收集

发酵结束后，采用连续离心机对步骤6)所得发酵液进行离心，收集菌体，冷冻保存。

7.根据权利要求6所述的一种提高Trx-hPTH(1-34)融合蛋白可溶性表达的发酵方法，其特征在于，步骤4)中，所述发酵培养基的组分包括：胰蛋白胨2％、酵母提取粉1％、甘油1％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.4％、硫酸钾0.24％、氯化钙0.113％、氯化铵0.1％，用氨水调pH至7.0。