[发明专利]编码Trx-hPTH（1-34）融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用

说明书

本发明一种编码Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用，5’端为编码Trx肽段的基因序列，其3’端为编码hPTH(1‑34)的基因序列，编码Trx肽段的基因序列与编码hPTH(1‑34)的基因序列之间为编码连接肽的基因序列，提高Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白可溶性表达水平。本发明提供的编码Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用，不含氨苄青霉素基因，工程菌发酵过程中不需要使用β‑内酰胺类抗生素，可降低环境污染，可溶性Trx‑hPTH(1‑34)融合蛋白在其总表达量中占比大于80％，可采用非变性条件纯化，提高生产效率。

技术领域

本发明属于生物工程制药技术领域，具体涉及编码Trx-hPTH(1-34)融合蛋白的基因序列、重组表达质粒、工程菌及应用。

背景技术

骨质疏松症是一种因骨量低下、骨微结构损坏导致骨脆性增加、易骨折的全身性骨病，多发于绝经后的女性、老年人，可因吸烟、酗酒、性腺功能减退、滥用皮质激素等原因所致，全球1/2的老年女性和1/3的老年男性将发生骨质疏松性骨折。骨质疏松症与糖尿病、阿尔茨海默病一起被WHO列为危害中老年人健康的三大杀手，对中老年人的健康构成了严重的威胁。

骨质疏松症的治疗药物包括：促进骨矿化药物、抗骨吸收药物、促骨生长药三大类。人甲状旁腺素(Parathyroid hormone，hPTH)是由人甲状旁腺分泌的由84个氨基酸组成的多肽分子。hPTH的N端肽链与hPTH-I受体结合发挥促进骨细胞生长的作用，而C 端肽链与hPTH-Ⅱ受体结合，可发挥促进骨细胞凋亡的作用，增强骨吸收。hPTH的N端 1-34肽(又称特立帕肽)是首先被FDA批准的可以促进骨合成代谢的药物，它与骨组织细胞上hPTH-I受体结合，直接刺激成骨细胞生长，间接增加肠道钙的吸收，增加肾小管钙的重吸收和增强磷酸盐在肾脏的排泄，同时也消除了hPTH的C端的促进骨凋亡作用。特立帕肽对骨骼的作用依赖于全身暴露模式，每天一次注射特立帕肽可通过优先刺激成骨细胞活性(相对于破骨细胞活性)，增加新骨在松质骨和皮质骨表面的积聚。人甲状旁腺素1-34肽(hPTH(1-34))已广泛应用于骨质疏松症及骨折患者的治疗。

人甲状旁腺素1-34肽的制备方法可以用化学合成法和基因工程重组表达法。化学合成法生产成本高，产能受到限制。采用基因工程重组技术在原核细胞大肠杆菌中进行大规模的发酵表达，具有成本低、生产周期短等明显优势，是制备肽类蛋白质原料药最常用一种方法。由于甲状旁腺素是一个真核细胞分子，其基因的天然编码DNA序列在大肠杆菌不是最优化序列，蛋白表达水平低，易形成包涵体，影响重组表达hPTH1-34的产量、纯化工艺、生物活性与纯度，难以满足商业化规模制药的需要。因此，迫切需要开发以可溶性表达为主的hPTH1-34工程菌及发酵、纯化工艺，提高重组hPTH1-34的生产效率。

中国发明专利，申请号：CN200610070995.4，专利名称：含有人甲状旁腺素1-34的融合蛋白及其表达载体，公开了一种编码融合蛋白的重组DNA序列，融合蛋白具有：

(1)硫氧还蛋白的序列；

(2)位于所述硫氧还蛋白下游的甲状旁腺激素1-34肽；和

(3)位于所述硫氧还蛋白和所述甲状旁腺激素1-34肽之间的含有肠激酶识别位点的连接肽，其中所述的肠激酶识别位点的C端直接连接所述甲状旁腺激素1-34肽的N端；并且，所述重组DNA序列包含编码所述融合蛋白中的所述肠激酶识别位点-甲状旁腺激素 1-34肽的下列核苷酸序列：

GACGACGACGACAAGTCCGTTTCCGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAA CACCTGAACTCCATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCAC AACTTC。