[发明专利]一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明属于分子诊断技术领域，特别是涉及一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试剂盒，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述预混液中包括：检测ERBB2基因的上下游引物、检测ERBB2基因的荧光探针、检测人ATCB内参基因的上下游引物、检测人ATCB内参基因的荧光探针；所述方法包括以下步骤：S1、提供被测者的检测样本，所述的检测样本为血浆样本；S2、从S1中血浆样本中，提取待测样本的ctDNA；S3、使用数字PCR平台对S2中提取样本进行扩增反应；S4、对扩增结果进行分析与判读；本发明提供的ERBB2基因扩增检测方法，是基于微液滴数字PCR检测系统，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，特别是涉及一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的方法及其检测试剂盒。

背景技术

酪氨酸激酶受体ERBB2(又名ERBB2/NEU)基因，编码185kDa的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，是EGFR家族成员之一。ERBB2基因的扩增或过度表达会导致细胞过度增殖而形成肿瘤。研究显示，大约25％～30％的浸润性乳腺癌和80％的胃癌患者均有ERBB2基因扩增或蛋白过表达。

ERBB2扩增或许可用于预测机体对ERBB2靶向治疗药物的敏感度，这类药物包括拉帕提尼、曲妥珠单抗、帕托珠单抗、T-DM1等。以最早使用也是最成功的曲妥珠单抗(赫赛汀)为例，临床研究表明，赫赛汀可显著延长ERBB2阳性乳腺癌患者的PFS(无进展生存期)和OS(总生存期)。赫赛汀联合化疗能将肿瘤的复发风险降低52％，将患者的死亡风险降低33％。此外，对于ERBB2表达阳性、无法手术切除的局部晚期、复发或转移的胃癌患者，接受曲妥珠单抗联合化疗的治疗效果显著优于单纯治疗。因此，准确判断ERBB2基因扩增状态对乳腺癌、胃癌等患者的预后判断及优化治疗方案均具有重要作用。

现阶段国内外一般采用免疫组织化学(IHC)法检测ERBB2蛋白的表达水平，采用荧光原位杂交(FISH)法检测ERBB2基因扩增水平。IHC具有成本低、技术简单、便于操作等特点，常是临床检测的首选方法。但IHC容易受到组织影响、缺乏标准化，结果判断存在主观差异，造成不同实验室之间的IHC检测结果可能存在差异。FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性较高，是目前ERBB2检测的金标准。但FISH存在价格昂贵、检测周期长、患者收费高、检测者专业知识和实验室条件的限制，不利于广泛应用。此外利用IHC/FISH方法无法对患者体内肿瘤细胞的ERBB2基因状态进行实时、动态的监测，来了解患者病情发展及治疗过程中ERBB2基因状态的变化情况。因此急需一种高灵敏度、准确度、易于操作标准化、多样化检测等优势检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒及其文库构建方法，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于数字PCR技术检测ERBB2基因扩增的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述预混液中包括：检测ERBB2基因的上下游引物、检测ERBB2基因的荧光探针、检测人ATCB内参基因的上下游引物、检测人ATCB内参基因的荧光探针；

所述检测ERBB2基因的上下游引物、探针包括如下序列：

上游引物：5'-ACAACCAAGTGAGGCAGGTC-3'SEQ ID NO:1；

下游引物：5'-GTATTGTTCAGCGGGTCTCC-3'SEQ ID NO:2；

探针：5'-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3'SEQ ID NO:3；

所述检测ATCB内参基因的上下游引物、探针包括如下序列：