[发明专利]靶向人EpCAM的重组CAR基因及其载体、CAR-T细胞及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种靶向人EpCAM的重组CAR基因，其特征在于，该重组CAR基因是由EpCAMhScFv、CD8、4-1BB共刺激因子和CD3ζT细胞激活域构成的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中：

所述EpCAMhScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述CD8的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述4-1BB共刺激因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述CD3ζT细胞激活域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种重组CAR基因载体，其特征在于，该重组CAR基因载体为掺入如权利要求1所述的靶向人EpCAM的重组CAR基因的核酸构建体、质粒、慢病毒或逆转录病毒。

3.如权利要求2所述的重组CAR基因载体，其特征在于，该重组CAR基因载体由EpCAMhScFv、CD8、4-1BB共刺激因子和CD3ζT细胞激活域构成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；其中：

所述EpCAMhScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述CD8的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述4-1BB共刺激因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述CD3ζT细胞激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

4.如权利要求2所述的重组CAR基因载体，其特征在于，该重组CAR基因载体为Anti-EpCAMhScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体，由Anti-EpCAM单链抗体重链VH、Linker、anti-EpCAM单链抗体轻链VL、CD8 Hinge嵌合受体铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激因子和CD3ζT细胞激活域构成；其中：

所述Anti-EpCAM单链抗体重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述Anti-EpCAM单链抗体轻链VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.一种靶向人EpCAM的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞是通过使用权利要求1的靶向人EpCAM的重组CAR基因或使用权利要求2～4所述的重组CAR基因载体转化T细胞制得。

6.权利要求5所述的靶向人EpCAM的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成Anti-EpCAMhScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体基因；

2)构建慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体具有Anti-EpCAMhScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ嵌合抗原受体基因；

3)利用步骤2)构建的慢病毒表达载体转染293T细胞，获得高滴度慢病毒；

4)利用步骤3)获得的高滴度慢病毒感染T细胞，获得靶向人EpCAM的CAR-T细胞。

7.权利要求1所述的靶向人EpCAM的重组CAR基因、权利要求2～4所述的重组CAR基因载体或权利要求5所述的靶向人EpCAM的CAR-T细胞在制备治疗高表达EpCAM分子的疾病的药物或试剂盒中的应用。

8.一种抗癌剂，其特征在于，含有权利要求5所述的靶向人EpCAM的CAR-T细胞及药学上允许的添加剂。