[发明专利]靶向人EpCAM的重组CAR基因及其载体、CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种靶向人EpCAM的重组CAR基因及其载体、CAR‑T细胞及其制备方法和应用，该CAR‑T细胞在T细胞内表达人源化抗EpCAM抗体ScFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ的融合蛋白。所述EpCAMhScFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ中，EpCAMhScFv可特异性识别结合人EpCAM蛋白。通过慢病毒感染活化的T细胞对其进行修饰和改造，制备了一批能够特异性识别和杀伤高表达EpCAM的肿瘤细胞的CAR‑T细胞，可应用于高表达EpCAM的肿瘤治疗，为其预防和治疗提供了新方法。

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，涉及一种靶向人EpCAM的重组CAR基因及其载体、CAR-T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

癌症因其具有发病率高和死亡率高等特点，成为人类健康与公共卫生安全的一大威胁。常用的治疗方法包括手术切除、放疗和化疗等，然而这些手段疗效有限，且不适用于所有患者，因此，肿瘤免疫治疗等疗法应运而生。CAR-T(Chimeric antigen receptor Tcell)细胞治疗的研究如火如荼，它是通过外源性人工设计的嵌合抗原受体(Chimericantigen receptor,CAR)对T细胞进行基因改造和修饰，使T细胞表达一种针对肿瘤特异性抗原(Tumor-specific antigen,TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen,TAA)的新的蛋白，从而提高T细胞对肿瘤的杀伤能力。CAR的结构主要包括胞外的抗原结合区、跨膜区和胞内的信号区三个部分，其不具有MHC限制性，避免了肿瘤细胞MHC表达下降而导致的免疫逃逸。胞外区为ScFv(Single chain variable fragment)片段；跨膜区连接胞外抗原结合区和胞内信号区，将CAR结构锚定于T细胞的细胞膜上，且参与CAR结构的二聚化；胞内结构域为T细胞激活结构域CD3ζ链和胞内共刺激结构域，提供T细胞活化的第一和第二信号。第一代的CAR胞内结构域仅有CD3ζ链，含有三个免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，只能传递T细胞激活的第一信号，因此抗肿瘤效果十分有限。第二代CAR和第三代CAR分别是在第一代CAR的基础上另外添加了一个和两个共刺激分子的CAR结构，如CD28、4-1BB、OX40、CD27、ICOS等，其中CD28和4-1BB较为常用，用于增强CAR-T细胞的增殖信号。使用4-1BB作为共刺激分子的CAR-T细胞杀伤作用较为持久，且细胞耗竭率更低。第四代CAR又增加了细胞因子或共刺激分子配体，如IL-12、4-1BBL等。CAR-T细胞免疫治疗是肿瘤免疫疗法的重要方法，目前在血液系统肿瘤中取得了令人瞩目的成效。

上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是分子量约为40kd的Ⅰ型跨膜蛋白，主要发挥粘附作用，参与细胞的增殖和迁移等生物学过程，其是最受关注的肿瘤相关抗原之一，促进多种肿瘤的发生发展。EpCAM常在原发肿瘤和转移瘤中高表达，尤其是腺癌、某些鳞状细胞癌和视网膜母细胞瘤。基于TCGA和GTEx数据库中RNA-seq数据的整合分析显示，EpCAM在多种癌症中过表达，且其过表达与患者的不良预后和治疗无反应性相关。此外，EpCAM还被认为是多种肿瘤的肿瘤干细胞标志之一，与CD44、CD117和CD133等，共同被广泛应用于肿瘤干细胞的表征。EpCAM+的乳腺癌细胞具有自我更新和分化能力，且相较于EpCAM-细胞，更具有侵袭性。高表达EpCAM的卵巢癌干细胞的克隆形成与肿瘤形成能力增强，并且对阿霉素和顺铂治疗无反应。此外，结直肠癌患者组织中EpCAM+/CD44+肿瘤干细胞与肿瘤的高侵袭性和肿瘤分级显著相关，表明EpCAM在促进肿瘤发生发展，影响患者生存及对化疗药物的耐药性方面具有重要作用。上述结果均表明，EpCAM是一种肿瘤相关抗原，可作为治疗肿瘤的良好靶点。