[发明专利]一种基于Wnt-5A/Ror2信号通路的软骨细胞增殖方法

说明书

本发明提供了一种基于Wnt‑5A/Ror2信号通路用于美容细胞再生的制剂和培养基，能够在提高软骨细胞增殖能力及再生的同时改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。本发明的细胞培养制剂可以降低基础培养基中通常的血清的使用含量，并显著促进软骨细胞的培养及再生，解决了美容软骨细胞培养使用的培养基成分复杂，培养困难，生长速度慢的问题。本发明的细胞增殖制剂是通过抑制Wnt‑5A/Ror2信号通路调控IL‑1β诱导软骨细胞的增殖及再生，因此，本发明的制剂可以作为一种信号因子用于软骨细胞的增殖及再生等，培养的细胞可以作为美容原料进一步应用于美容软骨损伤修复等。本发明提供的方法具有操作简单、方便的特点，适合推广应用。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种用于美容软骨细胞培养及再生的制剂及其应用。

背景技术

关节软骨由包围在由软骨细胞产生的复杂的细胞外基质中的软骨细胞组成。此基质独特的生物化学组成提供了光滑的、几乎无摩擦运动的关节连接表面。由于创伤或疾病例如类风湿和骨关节炎而对软骨造成的损伤，能够导致严重的身体虚弱。软骨损伤后自我修复能力比较弱，临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，去分化是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。所以改善与维持软骨细胞表型在软骨细胞的临床应用中起着举足轻重的作用。

注射用自体软骨，可能是面部整形外科手术领域长期研究所期望获得的最理想的填充材料。传统上，组织工程软骨是将软骨细胞播种在合成聚合物支架上，再植入宿主体内。理想的面部注射填充材料，应该是可以注射填充同时可以原位塑形，长时间保持形状不变形，这其实就是组织工程所生产的可注射用软骨材料。而注射软骨细胞聚合物，可以最小的创伤达到矫正颅颌面缺损的目的。目前已有报道，藻酸盐和人软骨细胞的混合物，可以被塑形成任何的尺寸和形状，用于注射填充美容整形治疗，观察38周以上，没有任何的消失或者吸收。

人软骨细胞通常在补加10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基。然而，尽管血清广泛用于哺乳动物细胞培养，但血清含有许多未经确定的或非定量的成分，因此不是“确定的”；且血清的组成依批次而有所变化，难以进行标准化；另外，血清成分影响细胞附着、增殖和分化，使得这些参数难以控制；最后，一些血清成分对于特定细胞的增殖是抑制性的，在一定程度上可能抵消其增殖效果，导致生长欠佳；以及血清可能含有病毒和其它病原体，可能影响实验结果，或如果培养细胞预期植入人体，则可能带来潜在的健康危害。

因此，使用确定的无血清培养基对于用于治疗软骨缺陷的软骨细胞离体扩增特别有利。或者，进一步发掘有利于软骨细胞增值的制剂以降低血清的浓度或使用水平，支持增殖直到得到汇合培养物，并维持软骨细胞再表达关节软骨表型的能力，这无疑是有利于后续培养的软骨细胞的进一步利用。

在现有技术中，一是通过改变培养基成分来改善细胞培养环境，以改善或维持软骨细胞表型，二是模拟体内培养模式，将软骨细胞接种于三维支架材料中对所述软骨细胞进行培养，使得软骨细胞回复初始的软骨细胞表型，但是，随着软骨细胞的增殖都会出现明显的去分化趋势，在体外培养与临床应用上受到了限制。

已有的研究发现，姜黄素以及绿原酸对于特定的软骨细胞具有保护或增殖的功能。比如，姜黄素被报道具有明显的抗炎抗氧化特性，姜黄素抑制 IL-1β对软骨细胞的炎性诱导与基质破坏作用，并在大鼠体内发挥软骨保护作用。因此姜黄素有望用于治疗颞下颌关节的炎症，缓解症状并减缓疾病的进展。

另外，绿原酸的生物活性广泛，随着研究的深入，许多新的药效被陆续挖掘，包括抗感染、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等。绿原酸能够通过抑制NLRP3 炎性复合体/核因子κB(NF-κB)通路发挥对关节炎的治疗作用。绿原酸或可作为治疗颞下颌关节骨关节炎的药物。

在临床工作中,治疗由于软骨缺损导致功能障碍或畸形的病人多用同种异体,自体或人工合成替代物治疗.但由于存在免疫排斥,取材受限及感染等问题,临床医生正在寻找一种更为理想的治疗方法.组织工程的应用是解决上述问题的一个新途径。