[发明专利]一种不依赖于纯化对PCR扩增产物直接进行Sanger测序的方法

说明书

本发明公开了一种不依赖于纯化对PCR扩增产物直接进行Sanger测序的方法。本发明公开的方法包括：1)利用5’端带有测序引物的引物对对待测DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；2)在含有测序引物与扩增产物的测序反应体系中进行测序反应，得到测序产物；测序引物的3’端带有不能被核酸外切酶进行切割的修饰；3)分析测序产物，得到待测DNA片段的序列，完成测序。本发明通过设计经特殊修饰的测序引物，可以不经过纯化，直接对PCR扩增产物进行下游测序反应和测序分析，从而精简了测序流程，缩短了测序时间，降低了操作的复杂程度，同时不需要纯化试剂，降低了检测成本，更有利于Sanger测序法在临床样本检测中的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种不依赖于纯化对PCR扩增产物直接进行Sanger测序的方法。

背景技术

以Sanger核酸测序法为代表的一代测序测序技术已广泛应用于临床，在多种疾病的预防、诊断及鉴别诊断、预后预测、用药指导、疗效评价等方面都发挥着重要的作用。此外，一代测序技术还被应用于移植配型、人类白细胞易感性疾病检测、亲子鉴定及产前筛查等。一代测序技术稳定、简便、自动化程度高、所得数据为直接基因组序列、数据准确、可重复性好，现被公认为基因检测的“金标准”。

Sanger法又称作双脱氧链终止法，是目前应用最多的核酸测序技术，由Sanger等人于1977年发明提出。目前美国ABI公司已开发生产岀373型、377型、310型、3130型、3730型、3500型、3500Dx，Seqstudio等多款基因分析仪。此类基因分析仪基于大小不同的分子在毛细管电泳中的迁移率不同的原理，当标记有荧光的分子逐一通过毛细管时，激光检测器即可对其逐个进行检测，并同步成像，随后分析软件自动将不同的荧光信号转变为核酸序列，从而实现测序目的。但是对于这种方法的测序需要首先对测序模板进行富集，富集的方法通常包括分子克隆后进行大肠杆菌培养扩增和PCR扩增法。PCR扩增法具有简单高效的特点，但是在扩增后需要进行PCR产物的纯化。目前通常的纯化方法包括琼脂糖凝胶回收法和酶解法，都存在过程繁琐，增加Sanger测序工作量的缺点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何进行DNA测序。本发明通过设计经特殊修饰的测序引物和改良的测序反应液，实现了对PCR扩增产物不经纯化直接进行测序反应，从而缩短了Sanger测的流程，提高了测序的效率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA测序方法，所述方法包括：

1)利用5’端带有测序引物的引物对对待测DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)在含有测序引物与所述扩增产物的测序反应体系中进行测序反应，得到测序产物；所述测序引物的3’端带有不能被核酸外切酶进行切割的修饰；

3)分析所述测序产物，得到所述待测DNA片段的序列，完成测序。

上述方法步骤2)中，所述不能被核酸外切酶进行切割的修饰可为对所述测序引物的3’端的核苷酸间的磷酸二酯键的修饰。

上述方法中，对所述测序引物的3’端的核苷酸间的磷酸二酯键的修饰可为对所述测序引物的3’端的n个核苷酸间的磷酸二酯键的修饰，n为大于等于2小于等于10的整数。

具体的，n可为3。

上述方法步骤2)中，所述修饰可为硫代修饰。

上述方法中，所述测序引物其设计原则和方法为本领域所公知，例如避免引物二聚体、发夹结构等。所述测序引物可为M13F和/或M13R，所述M13F由在序列表中序列1所示的单链DNA的3’端的三个核苷酸间的磷酸二酯键进行硫代修饰得到；所述M13R由在序列表中序列2所示的单链DNA的3’端的三个核苷酸间的磷酸二酯键进行硫代修饰得到。

上述方法步骤2)中，所述测序反应体系中可含有核酸外切酶。