[发明专利]一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用有效
申请号: | 202011558624.7 | 申请日: | 2020-12-25 |
公开(公告)号: | CN112285366B | 公开(公告)日: | 2021-06-08 |
发明(设计)人: | 山莽挺;刘莉;张小健;刘仁杰 | 申请(专利权)人: | 南京广祺医药科技有限公司 |
主分类号: | G01N33/68 | 分类号: | G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543 |
代理公司: | 南京乐羽知行专利代理事务所(普通合伙) 32326 | 代理人: | 朱磊 |
地址: | 210000 江苏省南京市栖霞区*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 测定 血清 特异性 抗体 bsab elisa 方法 应用 | ||
1.一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:包括以下步骤,
1) 用抗人hOX40-Fc Tag抗原包被微孔板,得到包被后的微孔板;
2) 将BsAb和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合,形成抗原-抗体复合物;
3) 将hPD-L1-hisTag 加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合,形成抗原-抗体-检测抗体复合物;
4)将Anti-His HRP 标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体-检测抗体复合物孵育结合,形成抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素复合物,加入底物显色;
5) 加入终止液终止反应,测定OD值;
6) 通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。
2.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤1) 中,所述抗人hOX40-Fc Tag抗原浓度为0.5ug/mL~4ug/mL,包被后的微孔板在4~8℃放置≥16小时;在放置后的微孔板中加入封闭液,并且在37℃孵育2小时。
3.根据权利要求2所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:所述抗人hOX40 -Fc Tag抗原浓度为 0.5ug/mL,所述封闭液为1%BSA/PBS。
4.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤2) 中,所述BSAB抗体浓度为混合食蟹猴血清标准曲线范围,37ng/mL~10000ng/mL;质量控制样品范围为37~8000ng/mL。
5.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤3) 中,所述h PD-L1-his Tag检测抗体浓度为0.5ug/mL~4ug/mL。
6.根据权利要求5所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:所述hPD-L1 -his Tag 检测抗体浓度为0.5ug/mL。
7.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤4) 中,所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:1000~1:10000。
8.根据权利要求7所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:8000。
9.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤4) 中,加入HRP酶的底物TMB显色时间5~20分钟。
10.根据权利要求9所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于: TMB底物显色时间8 分钟。
11.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:步骤5) 中,所述加入终止液时间5分钟内,在450nm、参比波长620nm 处用酶标仪测定吸光度值(OD值)。
12.根据权利要求11所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法,其特征在于:计算时,已知标准曲线,QC及血清样品中BSAB浓度计算通过Microsoft Excel 2010软件获取BSAB标准曲线浓度对数,然后通过SimaPlot10.0软件分别获取BSAB标准曲线浓度对数作为X和 Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合,标准曲线拟合方程如下,
f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B)),权重=1/y^2
获得方程参数后计算生物样品中的浓度。
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