[发明专利]一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用

权利要求书

1.一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于:包括以下步骤，

1) 用抗人hOX40-Fc Tag抗原包被微孔板，得到包被后的微孔板；

2) 将BsAb和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原-抗体复合物；

3) 将hPD-L1-hisTag 加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体复合物；

4）将Anti-His HRP 标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体-检测抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色；

5) 加入终止液终止反应，测定OD值；

6) 通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。

2.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤1) 中，所述抗人hOX40-Fc Tag抗原浓度为0.5ug/mL～4ug/mL，包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时；在放置后的微孔板中加入封闭液，并且在37℃孵育2小时。

3.根据权利要求2所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述抗人hOX40 -Fc Tag抗原浓度为 0.5ug/mL，所述封闭液为1%BSA/PBS。

4.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤2) 中，所述BSAB抗体浓度为混合食蟹猴血清标准曲线范围，37ng/mL～10000ng/mL；质量控制样品范围为37～8000ng/mL。

5.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤3) 中，所述h PD-L1-his Tag检测抗体浓度为0.5ug/mL～4ug/mL。

6.根据权利要求5所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述hPD-L1 -his Tag 检测抗体浓度为0.5ug/mL。

7.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤4) 中，所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:1000～1:10000。

8.根据权利要求7所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：所述Anti-His HRP 标记的亲和素1:8000。

9.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤4) 中，加入HRP酶的底物TMB显色时间5～20分钟。

10.根据权利要求9所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于： TMB底物显色时间8 分钟。

11.根据权利要求1所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：步骤5) 中，所述加入终止液时间5分钟内，在450nm、参比波长620nm 处用酶标仪测定吸光度值(OD值)。

12.根据权利要求11所述测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，其特征在于：计算时，已知标准曲线，QC及血清样品中BSAB浓度计算通过Microsoft Excel 2010软件获取BSAB标准曲线浓度对数，然后通过SimaPlot10.0软件分别获取BSAB标准曲线浓度对数作为X和 Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合，标准曲线拟合方程如下，

f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B))，权重=1/y^2

获得方程参数后计算生物样品中的浓度。