[发明专利]一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用

说明书

本发明涉及一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用，属于化学技术领域。本发明的方法包括以下步骤，1)用抗人hOX40(Fc Tag)抗原包微孔板，得到包被后的微孔板；2)将BsAb和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原‑抗体复合物；3)将hPD‑L1(his Tag)加入所述抗体包被的微孔板中与抗原‑抗体复合物孵育结合，形成抗原‑抗体‑检测抗体复合物；4）将Anti‑His HRP标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原‑抗体‑检测抗体复合物孵育结合，形成抗原‑抗体‑检测抗体‑HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色；5)加入终止液终止反应，测定OD值；6)通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。本发明的有益效果是：检测灵敏度高、误差小、特异性高。

技术领域

本发明涉及一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用，属于化学技术领域。

背景技术

双特异性抗体(BsAb) 是指同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组DNA技术制备实现。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。在抗体的研发过程中，通过药物在血浆中浓度检测来支持pharmacokinetic (PK) 与toxicokinetic(TK) 实验，快速推进项目进展起到非常重要的作用。通常ELISA检测方法有四大类；1)直接ELISA；2) 间接ELISA；3) 夹心ELISA；4) 竞争抑制ELISA。其它都属于这四类的组合衍生。而且是测定单抗浓度。PD-L1/OX4O作为一种双特异性抗体，在生产过程中通常会出现杂物抗体。如果用现有方法，使用的抗体针对目标抗体Fc段，杂质抗体也含有相同的Fc段，如果清洗步骤不彻底，该方法就会产生杂质抗体干扰，从而影响测定定量下线浓度(LLOQ) ，也就是会影响测定不正确性，PK参数计算错误，特别是半衰期计算(T1/2) 。误导给药频率与剂量产生毒性导致药物开发失败。为排除杂质抗体在测定过程中干扰，有必要开发一种新的定量测定血清中双特异性抗体(PD-L1/OX40)的ELISA方法来满足双特异抗体在研发过程中PK与TK血浆样品测定。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法及应用,提高检测灵敏度。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：一种定量测定血清中双特异性抗体BsAb的ELISA方法，包括如下步骤：

1) 用抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原包微孔板，得到包被后的微孔板；

2) 将双特异性抗体和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成“抗原-抗体”复合物；

3) 加入h PD-L1(hisTag) 所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合，形成“抗原-抗体-检测抗体”复合物；

4）加入Anti-His HRP 标记的亲和素所述抗体包被的微孔板中与“抗原-抗体-检测抗体”复合物孵育结合，形成“抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素”复合物，加入底物显色；

5) 终止液终止反应，测定OD值；

6) 通过BsAb标准曲线计算待测样品在血清中BsAb浓度。

本发明通过以下技术方案进一步解决技术问题，上述方法的

步骤1) 中，所述抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原浓度为0.5ug/mL～4ug/mL；优选地，所述抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原浓度为 0.5ug/mL；用抗人hOX40 (Fc Tag) 抗原包微孔板，得到包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时，放置后的微孔板加入封闭液，并且在37℃孵育2小时；

步骤2) 中，所述己知BsAb抗体浓度配制在混合食蟹猴血清标准曲线范