[发明专利]一种人干扰素-κ突变体及其制备方法

说明书

本发明涉及人干扰素‑κ(hIFN‑κ)突变体及其制备方法。所述的hIFN‑κ变体是将hIFN‑κ的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位游离的半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，或者突变为与丝氨酸结构相近的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。与含有野生型hIFN‑κ序列的菌株相比，含有本发明的突变体序列的质粒的菌株表达产生的hIFN‑κ产量较高，与干扰素‑κ受体结合的亲和力更高，体外活性也更好。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人干扰素-κ的突变体及其制备方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。

干扰素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN-κ比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ基因位于第9对染色体短臂，与其他Ⅰ型IFN的基因邻近，其他Ⅰ型IFN基因无内含子，但IFN-κ基因的3′端非编码区含有1个内含子。目前，有研究发现编码IFN-κ基因选择性的在上皮角蛋白细胞中表达，重组的hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述的表达具有种族的特异性。

天然干扰素-κ序列中含有两对二硫键和一个单独未成对的半胱氨酸。干扰素-κ的体外表达一直是个难题，目前都采用原核表达的方法，但通常都以包涵体形式表达，因而在蛋白质复性过程中蛋白的正确折叠和二硫键的正确配对便成了关键。另外，在复性过程中，游离半胱氨酸的存在往往对这种正确折叠和配对带来干扰，同时也使得蛋白在复性过程中形成聚集体而失活。

因此，改善蛋白质复性过程中蛋白的正确折叠和二硫键的正确配对，减少干扰素-κ在复性过程的蛋白质聚集，对于提高干扰素-κ蛋白的纯度显得尤为重要。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种干扰素-κ突变体，其与未突变的天然干扰素-κ蛋白相比，在与受体结合亲和力和活性方面都具有显著的改善。

本发明的另一目的在于提供一种制备干扰素-κ突变体的方法，通过培养、诱导表达、收集包涵体、复性、层析等操作，实现了较高的复性效率，且所获得的蛋白具有更高的活性。

本发明的目的通过包括以下的本申请的技术方案来实现：

根据本发明的一个方面，提供一种人干扰素kappa(hIFN-κ)突变体。

在所述突变体中，天然hIFN-κ的氨基酸序列中第166位的半胱氨酸突变为不能形成二硫键的氨基酸残基，其中所述突变体可以消除蛋白表达纯化过程中包涵体的复性过程中对于正确折叠的影响。

在所述hIFN-κ突变体中，1)天然存在的hIFN–κ的对应于SEQ ID NO:1中第166位置上的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中的任一种，优选为丝氨酸；或，2)来源于人且与SEQ ID NO:1具有99％同源性的氨基酸序列的对应于SEQID NO:1的第166位的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中的任一种，优选为丝氨酸；或，3)所述hIFN-κ突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，所述20种天然氨基酸为本领域已知的20种天然氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。

根据本发明的第二方面，提供一种编码所述hIFN-κ突变体的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。