[发明专利]一种外泌体冻存保护液及其制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种外泌体冻存保护液及其制备方法。该外泌体冻存保护液包括：含NaCl、KCl的Tris‑HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD‑Lipid浓缩液、人血清白蛋白溶液、聚乙烯醇。本发明提供的外泌体冻存保护液的配比合理，成分简单，组成明确，加入所述冻存保护液的外泌体能在‑20℃的低温条件下，稳定保存6‑12个月，其生物学活性能维持其最大活性的90％；本发明冻存保护液中所有组分的构成明确，可以工业化生产，原材料价格便宜、易获取，具有低成本优势。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种外泌体冻存保护液及其制备方法。

背景技术

干细胞分泌的外泌体是直径在30-150nm的囊泡，由与细胞质膜相同的脂质双分子层包裹，内部含有蛋白质和RNA等生物活性物质。间充质干细胞(MSCs)以旁分泌方式发挥作用，其机制为干细胞通过产生大量细胞因子和生长因子，以及产生外泌体(exosomes)来起到组织修复的作用。目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。研究发现，干细胞分泌的外泌体能模拟干细胞的生物学功能，也逐渐被证实能促进组织修复和治疗一些难治性疾病，具有广阔的应用前景。与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。因为干细胞外泌体作为治疗产品具有干细胞制剂不具有的某些特性，例如外泌体相比活细胞而言，成分比较确定，易于质量控制，因此这些特性使得外泌体具有很大的应用价值。越来越多的研究表明，干细胞外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学作用。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死、皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景。

外泌体的稳定性低、容易失活，为了维持外泌体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。外泌体生物活性的丧失多发生在贮存保藏阶段，一般制成液体制剂超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度保存稳定的主要挑战之一就是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。另外，超低温保存的时间过长在使用过程中反复冻融或者使用不当，外泌体的生物活性往往会迅速大幅下降，从而限制了它的正常使用。

现有技术中通常通过添加冻存保护剂来保存外泌体的活性，例如培养基或牛血清，但在培养基中冻存3个月内的外泌体的活性急剧下降，牛血清保存的外泌体中还存在潜在的致病因子，并造成外泌体批间稳定性不一致。也有针对外泌体设计的冻干制剂方法，这类试剂虽能一定程度上保存外泌体的活性，但试剂的成份复杂，制备较繁琐，并不利于外泌体制剂质量的控制。

因此亟需一种成分简单、能在较低温下长期保存外泌体且不影响其活性的冻存保护试剂及方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种外泌体冻存保护液及其制备方法。该外泌体冻存保护液成分简单、能在较低温下长期保存外泌体，且不影响其活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种外泌体冻存保护液，外泌体冻存保护液包括：含NaCl、KCl的Tris-HCl缓冲溶液、葡萄糖、CD-Lipid浓缩液、人血清白蛋白(HSA)溶液、聚乙烯醇(PVA)。

作为优选，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：

优选地，以重量份计，外泌体冻存保护液中各组分的用量为：