[发明专利]重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种重组聚合酶，其特征在于，所述重组聚合酶来源于Thermus aquaticus YT-1菌株中的Taq DNA聚合酶蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接蛋白Cl7而得到的杂合DNA聚合酶，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序。

2.如权利要求1所述重组聚合酶，其特征在于，所述Cl7氨基酸序如SEQ ID NO.1所示。

3.一种编码如权利要求1～2任意一项所述重组聚合酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种如权利要求1～2任意一项所重组聚合酶的制备方法，所述重组聚合酶的制备方法包括以下步骤：

步骤一，根据GenBank已经公布的Taq基因序列以及Cl7基因序列信息设计并合成引物，并通过Overlap PCR技术扩增得到带有纯化标签、酶切位点的Cl7-Taq序列；

步骤二，将步骤一中得到的Cl7-Taq克隆至表达载体pET30a中构建重组载体pET30a-Cl7-Taq；

步骤三，表达载体pET30a-Cl7-Taq转化大肠杆菌、诱导表达得到目的蛋白Cl7-Taq。

5.如权利要求4所述的重组聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述重组载体pET30a-Cl7-Taq的构建方法，包括：

在合成的Taq基因序列C末端附加6个组氨酸作为标签，目标基因利用引物Taq-Linker和Taq-his进行PCR扩增，包含有T7启动子、核糖结合位点、T7终止子以及卡拉抗性的pET30a载体作为目标基因的高拷贝克隆载体，利用同源重组的方式将Taq基因克隆在质粒pET30a重组载体pET30a-Taq；重组后的pET30a-Taq基因被转化进入感受态细胞并进行DNA测序验证；

根据发布的Cl7氨基酸序列合成其基因序列，根据无酶克隆的方法利用柔性linker将Cl7连接到Taq的N末端，利用引物Cl7-F、Cl7-Linker、Taq-Linker、Taq-his进行PCR扩增从而将Taq、linker、Cl7三个片段的基因组合在一起，提取完整的重组质粒pET30a-Cl7-Taq并用DNA测序进行验证；其中，编码所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求4所述的重组聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述表达载体pET30a-Cl7-Taq转化大肠杆菌、诱导表达得到目的蛋白Cl7-Taq，包括：

(1)将经过测序验证的阳性重组表达质粒pET30a-Cl7-Taq转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，挑取单个菌落在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃摇床过夜培养；

(2)将过夜菌液以1/100的比例接种至500ml含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导；同时设置表达载体对照组，18℃低温诱导表达12h后取菌液，12000r/min离心10min，去上清；

(3)Ni-NTA裂解缓冲液重悬菌沉淀，超声破碎后，10000r/min离心20min，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳；将上清置于75℃热水浴20min后，10000r/min离心20min，去掉已变性的蛋白；

(4)利用AKTA蛋白纯化系统，Ni Sepharose 6Fast Flow亲和层析柱，对目的蛋白进行亲和纯化，上样缓冲液20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 9.0；洗脱缓冲液20mMTris-HCl，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH 9.0；

(5)收集蛋白洗脱峰样品并对蛋白样品进行4℃超滤，10mM Tris-HCl，100mM KCl，1mMDTT，0.2mM EDTA，pH 8.0；蛋白样品保存于-80℃冰箱中。