[发明专利]重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用

说明书

本发明属于分子生物学和蛋白质工程技术领域，公开了一种重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用，重组聚合酶来源于Thermus aquaticus YT‑1菌株中的Taq DNA聚合酶蛋白序列N端以柔性连接序列共价连接蛋白Cl7而得到的杂合DNA聚合酶，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序。本发明表达载体pET30a‑Cl7‑Taq转化大肠杆菌、诱导表达得到目的蛋白Cl7‑Taq。本发明大大提高TaqDNA聚合酶在PCR核酸扩增的持续合成能力，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学和蛋白质工程技术领域，尤其涉及一种重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用。

背景技术

目前，随着大规模测序及基因诊断的快速发展，目前，应用最为广泛的核酸扩增技术是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)。PCR技术广泛应用于分子克隆、基因组测序以及临床诊断等生命科学的各个领域，推动了精准医疗领域的发展，加速了基因与遗传病相关性的研究。在生物学研究、医学检验、法医鉴证及农业等相关领域，核酸的扩增都是一种非常重要的技术。PCR技术利用反应温度的循环变化来实现目的序列的变性、复性和延伸，能够在2-3小时之内实现目的序列的指数级扩增。然而，PCR技术也面临很多方面的局限性，血液和组织样本不能直接用于PCR反应，需要进一步提取DNA，限制了PCR技术的快速应用。

近些年，在DNA、RNA合成的分子生物学领域有许多的研究进展，许多在体内核酸扩增过程中发挥重要辅助作用的蛋白被相继发现。有研究表明，将Sso7d与来源于DNA聚合酶I家族和II家族的高温DNA聚合酶共价连接，能够显著提高高温DNA聚合酶的持续合成能力。在这些研究进展的基础上，研究人员应用q-PCR、RT-PCR、数字PCR，以及ARMS-PCR技术来检测癌症基因、以及流感病毒的诊断与筛查等。因此，Taq DNA聚合酶在PCR诊断、原位PCR和司法鉴定中有着广泛的应用前景。

在PCR核酸扩增过程中，常常使用Taq DNA聚合酶促进扩增。Taq DNA聚合酶是来源于Thermus aquaticus YT-1菌的提取酶。天然的Taq DNA聚合酶的持续合成能力不高，也就是说该聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。如何改进Taq DNA聚合酶，提高持续合成能力，加快PCR核酸扩增速率是亟待解决的问题。

Cl7是一种来源于大肠杆菌的非特异性DNA结合蛋白。因此，将Cl7与DNA聚合酶Taq共价连接或许能够为DNA聚合酶的改造提供一种新的思路。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)PCR技术也面临很多方面的局限性，血液和组织样本不能直接用于PCR反应，需要进一步提取DNA，限制了PCR技术的快速应用。

(2)天然的Taq DNA聚合酶的持续合成能力不高，该聚合酶与模板结合一次能催化的聚合反应数目较少。

解决以上问题及缺陷的难度为：现有的Taq DNA聚合酶在对底物的灵敏性不高，对应的灵敏度高的突变体现在还没找到，目前市面上的Taq DNA聚合酶大多达不到对体液或者样本直接进行检测的目标。

解决以上问题及缺陷的意义为：Cl7是一种DNA结合蛋白，本发明将该蛋白融合在Taq DNA聚合酶的N端后，提高了Taq DNA聚合酶对底物的结合能力，使得原本的Taq DNA聚合酶的活性能发挥出来，从而达到用Cl7-Taq重组DNA聚合酶能够直接检测体液或者血液样本中的目标基因。从而实现利用该酶进行疾病检测和诊断。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组聚合酶、编码基因、制备方法、载体、试剂盒及应用，具体涉及一种Cl7-Taq重组DNA聚合酶及其制备方法与应用。