[发明专利]热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明属于生物酶工程技术领域，具体涉及热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。所述的烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的野生型烟酰胺核糖激酶相比，在SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的15个位点中的任意一个或多个位点进行单点或多点联合突变。本发明所提供的烟酰胺核糖激酶突变体可用于β‑烟酰胺单核苷酸的合成制备。本发明构建的烟酰胺核糖激酶突变体与野生型酶相比，该突变体的热稳定性和单位酶活均得到大大提高，从而可以显著提升酶的反应温度，加快反应速率，降低反应时间和生产成本提高NMN收率，具有大规模工业应用的广泛前景。

技术领域

本发明涉及生物酶工程技术领域，具体涉及热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononuclotide，NMN)，是一种自然存在的生物活性核苷酸，NMN有2种不规则存在形式，α异构体和β异构体。其中，β异构体是NMN的活性形式，分子量为334.221g/mol。NMN是哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamideadenine dinucleotide，NAD⁺，又称辅酶I)合成途径的重要中间体。近年来在Science、Nature、Cell等国际权威学术杂志上的相关研究报道表明，补充NMN可有效地增加和恢复体内辅酶I水平，大幅延缓衰老和防止老年痴呆症等多种神经元退化疾病，并由此从根本上调理和改善衰老的各种症状。因此以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。目前NMN在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以NMN为主要成份开发出多种保健品，如美国HERBALmax、基因港GeneHarbor NMN9000、日本MIRAI LABNMN3000胶囊等。

NMN目前的生产方法主要有三种：固态酵母发酵工艺、体外酶催化工艺和化学法合成工艺。其中：(1)固态酵母发酵工艺复杂，产量较低，因此产品价格高昂。(2)化学法合成工艺以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到。虽然技术容易控制，但产品中杂质过多，分离纯化困难且总体收率很低；同时有机溶剂使用量大，对环境污染不可忽视。(3)酶作为一类与化学合成互补的、高效的生物催化剂已被广泛应用于新药研发、食品、化工等领域。目前主流的NMN生产工艺都是采用安全绿色的体外酶催化工艺。

主流的NMN的生物酶法制备是以烟酰胺核糖(nicotinamide riboside，NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NR kinase，NRK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN。对于酶催化反应来说，在酶的最适反应温度范围内，反应速率隨著温度的升高而急剧增加，从而缩短反应时间。然而，目前已报道的合成NMN的酶均为常温反应的酶，热稳定性不高，最适反应温度低于37℃，反应速率低，反应时间较长；同时也不利于酶液的长期保存。

如中国专利CN110373398A公开了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO.2中第D45位、第D58位、第R161位、第Y164位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变或四个联合突变中的一种突变；该新型烟酰胺核糖激酶突变体工业酶用于β-烟酰胺单核苷酸的合成制备，具有酶成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点。但对于酶的热稳定性及酶活并没有明显提高。

然而目前关于烟酰胺核糖激酶的研究仍然较少，限制了生物酶催化一步反应法制备NMN工业化生产中的应用。通过定向突变方法提高烟酰胺核糖激酶的热稳定性及酶活性，将十分有助于实现工业上减少酶量，降低生产成本。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性和活性增强的烟酰胺核糖激酶突变体及其编码基因和应用，以解决现有NRK热稳定性不高、反应速率低、反应时间较长，难以实现工业化生产的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：