[发明专利]一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法

权利要求书

1.一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌SE50/110中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，获得阿卡波糖高产突变株；

所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_5445，其序列如SEQ ID NO.1所示；

或，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_3989，其序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因具体包括如下步骤：

S1，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_5445的同源重组质粒I；

S2，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_3989的同源重组质粒II；

S3，通过接合转移将同源重组质粒I、II分别导入受体菌株中进行同源重组；

S4，进行安普霉素抗性验证，之后进行双交换筛选并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，得到基因敲除的突变株。

3.如权利要求1所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，得到基因敲除突变株；将基因敲除突变株在固体培养基上活化，然后将活化后的菌丝体接种在一级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养30~36小时；按照10%~15%的接种量转接至二级种子培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养24~28小时；按照10%~15%的接种量转接至发酵培养基中于28°C~30°C、180~220 rpm的转速下培养90~96小时后收取发酵液。

4.如权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述固体培养基含有质量体积比为3%~5%的蔗糖、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.5%~1%的酪蛋白水解物、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化钾和0.005%~0.01%的硫酸亚铁；所述发酵培养基含有质量体积比为5%~10%的麦芽糖、1%~5%的葡萄糖、0.1%~0.5%的谷氨酸、0.1%~0.5%的磷酸氢二钾、0.05%~0.1%的氯化铁、1%~5%的黄豆饼粉和0.1%~0.5%的碳酸钙。

5.如权利要求3所述的提高阿卡波糖发酵水平的方法，其特征在于，所述一级种子培养基含有质量体积比为1.5%~2%的葡萄糖、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的麦芽提取物、1%~2%的甘油、0.5%~1%的蛋白胨、0.5%~1%的酵母提取物、0.1%~0.2%的磷酸氢二钾和0.1%~0.2%的酪蛋白水解物；所述二级种子培养基含有质量体积比为4%~5%的黄豆饼粉、1%~2%的麦芽糖、1%~2%的葡萄糖、1%~2%的甘油、1%~2%的可溶性淀粉和0.25%~0.5%的碳酸钙。