[发明专利]一种敲除负调控蛋白基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法

说明书

本发明公开了一种敲除负调控基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法。采用本发明方法，通过在游动放线菌中，分别敲除负调控蛋白基因ACPL_5445和ACPL_3989，得到阿卡波糖高产突变菌株。通过本发明敲除负调控蛋白基因，可以促进阿卡波糖生物合成基因的表达，最终明显提高阿卡波糖产量。与出发菌株相比，本发明所得的高产菌株发酵产量分别提高了13％和8％，实验室摇瓶发酵水平分别达到3.62g/L和3.47g/L。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体说是涉及一种敲除负调控基因以提高阿卡波糖发酵水平的方法；通过在游动放线菌中敲除负调控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖产量。

背景技术

目前，患糖尿病人数在全球范围内持续增长。2型糖尿病是最常见的糖尿病，约占糖尿病总数的90％以上。许多的临床研究证明，餐后血糖的合理控制能够有效减缓或减少部分心脑血管慢性并发症的发生，口服降糖药物并结合饮食结构控制与适量运动是行之有效的干预方法。目前用于治疗糖尿病的经典降糖药主要有促胰岛素分泌剂、胰岛素增敏剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等。

阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶抑制剂的代表药物，其主要是通过竞争性抑制，降低小肠内的葡萄糖苷酶、蔗糖酶、淀粉酶等的活性，减缓糖类物质分解形成葡萄糖的过程，从而有效降低餐后血糖。由于阿卡波糖不仅可以降低血糖水平，还具有减小血糖波动、调节体脂代谢和预防心血管疾病等功效，因此，自上市以来便成为治疗2型糖尿病的理想药物。在2017年版本的《中国2型糖尿病防治指南》中，阿卡波糖被列入治疗2型糖尿病的一线用药。

阿卡波糖主要由放线菌产生，游动放线菌SE50及其基因工程改造后的高产菌株SE50/110都是非常重要的阿卡波糖产生菌。负责阿卡波糖生物合成的相关基因在游动放线菌SE50的基因组上成簇分布，组成acb基因簇。迄今为止，涉及阿卡波糖生物合成途径中相关转录调控因子及其调控机制的研究仍旧很少。在本发明的研究中，挖掘到与acb基因簇转录调控相关的基因ACPL_5445和ACPL_3989，敲除这两个调控蛋白基因，可以提高阿卡波糖生物合成基因的转录水平，从而提高阿卡波糖的产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过敲除负调控基因来提高阿卡波糖发酵水平的方法。通过在游动放线菌中敲除负调控基因ACPL_5445和ACPL_3989，以提高阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖产量。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明涉及一种提高阿卡波糖发酵水平的方法，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，从而提高阿卡波糖的发酵产量。是在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因，增强阿卡波糖生物合成基因转录水平，获得阿卡波糖高产突变株。对所述突变株进行发酵培养，获得阿卡波糖。

作为本发明的一个实施方案，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_5445，其序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的一个实施方案，所述负调控蛋白基因为负调控蛋白基因ACPL_3989，其序列如SEQ ID NO.2所示。

作为本发明的一个实施方案，在游动放线菌中敲除负调控蛋白基因具体包括如下步骤：

S1，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_5445的同源重组质粒I；

S2，设计并构建用于敲除负调控蛋白基因ACPL_3989的同源重组质粒II；

S3，通过接合转移将同源重组质粒I、II分别导入受体菌株(QQ-2)中进行同源重组；

S4，进行安普霉素抗性验证，之后进行双交换筛选并提取基因组通过PCR产物片段大小的差异，得到基因敲除的突变株。