[发明专利]一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用

权利要求书

1.一种菌株茂原链霉菌IPIO，其特征在于，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIO，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCNO：M 2020196，保藏日期为2020年6月10日。

2.一种菌株IPIO-BXL1，其特征在于，所述菌株IPIO-BXL1通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIO中整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的质粒表达获得的。

3.如权利要求2所述的菌株IPIO-BXL1，其特征在于，其为可以用卡那霉素进行筛选的菌株IPIO-BXL1；和/或，所述谷氨酰胺转氨酶基因的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述出发菌株IPIO-BXL1含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒。

4.如权利要求3所述的菌株IPIO-BXL1，其特征在于，所述表达盒含有：谷氨酰胺转氨酶基因的启动子、抗性基因neo。

5.一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤(1)：通过在如权利要求1所述的茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO-BXL1；

步骤(2)：通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选诱变后的突变菌株，从而获得筛选效率提高的高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括以下步骤：

(1.1)设计并构建用于抗性筛选的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的整合型质粒载体pTDS001；

(1.2)将第一步构建得到的整合型质粒载体pTDS001通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌IPIO中，在染色体上插入谷氨酰胺转氨酶基因的启动子及其控制抗性基因neo，并通过抗性和PCR验证筛选得到诱变的所述出发菌种IPIO-BXL1。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括以下步骤：

(2.1)将出发菌株IPIO-BXL1涂布在不同卡那霉素的固体培养基上，确定出发菌株IPIO-BXL1的抗性；

(2.2)将出发菌株IPIO-BXL1的孢子通过ARTP或NTG进行诱变，获得诱变后的孢子；

(2.3)将诱变后的孢子涂布在更高浓度卡那霉素的固体培养基上进行筛选。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS001是通过PCR扩增得到1008bp的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子序列及795bp的抗性基因neo的PCR片段，通过一步组装的方法连入整合型质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点得到的。

9.菌株IPIO-BXL1的构建方法，其特征在于，所述构建方法为，在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO-BXL1；所述方法包括以下步骤：

第一步：设计并构建用于抗性筛选的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的整合型质粒载体pTDS001；

第二步：将第一步构建得到的整合型质粒载体pTDS001通过接合转移导入受体菌茂原链霉菌IPIO中，在染色体上插入谷氨酰胺转氨酶基因的启动子及其控制抗性基因neo，并通过抗性和PCR验证筛选得到诱变的所述出发菌种IPIO-BXL1。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述整合型质粒载体pTDS001是通过PCR扩增得到1008bp的谷氨酰胺转氨酶基因的启动子序列及795bp的抗性基因neo的PCR片段，通过一步组装的方法连入整合型质粒pSET152的XbaI/EcoRI位点。