[发明专利]一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用

说明书

本发明提出一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，通过在茂原链霉菌IPIO中，利用谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达，获得诱变的出发菌种IPIO‑BXL1；通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选诱变后的突变菌株，从而获得高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株。本发明还提出了一种出发菌株IPIO‑BXL1及其构建方法。本发明显著提高筛选获得高产谷氨酰胺转氨酶菌株的效率，大为节省筛选菌株的人力物力，具有广泛产业化应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法及应用。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(TGase)是由茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)产生的一种单亚基蛋白，它能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而改变蛋白质的功能性质。TGase是外分泌蛋白，在胞内为pre-pro-MTGase初始形式，穿过细胞膜成为无活性的酶原pro-TGase，经过金属蛋白酶TAMEP切割信号肽成为FRAP-TGase，再经丝氨酸蛋白酶SM-TAP切割成为最终成熟的 TGase。TGase作为一种蛋白交联剂，因其稳定性好、使用安全等优点而被广泛应用，在食品领域通过交联谷氨酰胺残基和赖氨酸残基能够将小块肉类结合成大块提高食品的美观度，通过整合氨基酸增加营养，生物合成TGase制作可降解塑料包装；在医药领域可用来交联抗体和药物分子生产抗体偶联药物，催化明胶和胶原蛋白形成支架植入人体使器官再生等等。目前工业生产获得高产TGase的菌株多为诱变后进行筛选，但传统筛选费时、费力，获得高产TGase菌株的效率低下。

发明内容

本发明克服现有技术存在的问题，提出一种利用卡那霉素高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法，通过利用含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达的出发菌株，通过提高固体培养基中抗生素浓度进行筛选诱变后的菌株，从而获得谷氨酰胺转氨酶基因高表达的菌株，进而提升高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株筛选效率的方法。

本发明提出高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株的方法。该突变株基于利用含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达的出发菌株，通过高浓度抗性筛选提高高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株筛选效率。

本发明提出了菌株茂原链霉菌IPIO，所述菌株的分类名为茂原链霉菌Streptomyces mobaraensis IPIO，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2020196，保藏日期为2020年6月10日。

本发明所述菌株茂原链霉菌IPIO由泰兴东圣生物科技有限公司经菌种诱变获得。

本发明还提出了一种出发菌株，即IPIO-BXL1，其是通过在茂原链霉菌IPIO中整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的质粒表达获得的。

所述出发菌株IPIO-BXL1可以用于卡那霉素筛选。

所述出发菌株IPIO-BXL1含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒。

进一步的，该菌株由茂原链霉菌IPIO整合了含有谷氨酰胺转氨酶基因的启动子控制抗性基因neo的表达盒的质粒后而获得。

其中，所述谷氨酰胺转氨酶基因的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提出了一种表达盒，所述表达盒含有：谷氨酰胺转氨酶基因的启动子、抗性基因 neo。

本发明还提出了所述表达盒在高效筛选高产谷氨酰胺转氨酶生产菌株中的应用。

本发明还提出了利用卡那霉素高效筛选以提高高产谷氨酰胺转氨酶菌株的筛选方法，所述方法包括以下步骤：