[发明专利]一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法

说明书

本发明提供一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，将含有血清1型鸭甲型肝炎和血清3型鸭甲型肝炎的混合抗原接种7~9日龄SPF鸡胚，24小时内死亡鸡胚弃去，收集接种后24~120小时所有的鸡胚组织，进行总RNA提取，分别利用DHAV‑1和DHAV‑3特异性引物进行RT‑PCR检测，琼脂糖凝胶电泳后，统计PCR阳性数，计算两种抗原的鸡胚半数感染量（EID₅₀），从而避免了两种病毒鸡胚毒价测定时的相互影响。本发明提供的两株鸭甲型肝炎病毒对于SPF鸡胚的接种增殖均具有良好的适应性，尤其适用于本发明所述的检测方法。

技术领域：

本发明属于疫苗生产技术领域，具体涉及一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法。

背景技术：

鸭甲型肝炎病毒(DHAV)是小RNA科禽肝病毒属的唯一成员。该病毒感染3周龄以内的雏鸭后，死亡率达90％以上，世界范围内均可发生。1945年鸭甲型肝炎于美国首次报道，并于1950年首次成功分离到该病毒。迄今，通过进化树的分析和血清中和试验等相关数据，将DHAV分成三个血清型，DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3，其中血清1型鸭甲型肝炎病毒 (DHAV-1)为经典毒株，血清2型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-2)仅仅在中国台湾有报道。

众所周知，我国是养鸭大国，目前鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总量的 70％以上，鸭肝炎一直是我国养鸭生产的头号疫病，目前在国内DHAV-1和DHAV-3同时流行，流行的地域分布也在不断扩大，混合感染的情况也十分普遍，养鸭生产中对于二价疫苗的需求迫切。对于鸭肝炎二价疫苗的效力检验常用的方法，一是通过免疫攻毒保护试验，二是通过鸡胚测定疫苗抗原效价。其中攻毒保护试验方法需要使用的试验动物数量较多，且动用强毒存在生物安全风险。而鸭甲型肝炎病毒不同血清型之间存在部分的交叉反应，且不同毒株之间的交叉反应程度不尽相同，因此二价(或多价)疫苗抗原含量测定时，需要用血清对另一种(或几种)疫苗病毒进行中和，这就导致疫苗抗原效价测定结果不准确。基于此，本发明设计一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法来解决上述问题。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，以克服由于鸭甲型肝炎病毒不同血清型之间中和试验的相互影响，而造成疫苗效价结果不准确的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种鸭甲型肝炎二价活疫苗效力检验方法，包括以下步骤：

S1、取待检二价活疫苗，接种7～9日龄SPF鸡胚，所述二价活疫苗同时含有血清1型鸭甲型肝炎弱病毒(如A66株)和血清3型鸭甲型肝炎弱病毒(如HuB60株)；

S2、弃去接种后24h内死亡的鸡胚，收集接种后24h～120h鸡胚胚体；

S3、将S2中收集的鸡胚胚体进行总RNA提取，利用RT-PCR方法分别确定两种病毒对鸡胚的感染阳性数量，判定其半数感染量(EID₅₀)。

进一步的，步骤S1具体为：取待检二价活疫苗进行10倍系列稀释，取相应稀释度，将每个稀释度的待检二价活疫苗接种7～9日龄SPF鸡胚各5枚。

进一步的，步骤S2具体为：逐日照胚，将接种后24h内死亡的鸡胚弃去，将接种后24h～120h死亡的鸡胚置4℃冰箱暂存，至120h后取出所有鸡胚。

进一步的，步骤S3具体为：将S2中收集的接种后24h～120h内鸡胚胚体，通过总RNA提取，利用DHAV-1特异性引物和DHAV-3特异性引物分别对7～9日龄接种组鸡胚组织进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后，统计两种病毒PCR阳性数，即该病毒对鸡胚的感染阳性数量，计算两种抗原的鸡胚半数感染量(EID₅₀)。

本发明还提供一种血清1型鸭甲型肝炎弱毒株(A66株，Duck hepatitis virus)，保藏编号为：CGMCC No.8020。