[发明专利]一种壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的筛选方法

说明书

本发明要解决的技术问题是提供一种壳聚糖水解酶的可逆抑制保护剂的筛选方法，弥补现有技术存在的不足，适用于壳聚糖水解酶在工业酶制剂上的应用，提高其稳定性。本发明的设计思路如下：首先建立已知的可逆抑制保护剂训练集，根据已有的壳聚糖水解酶结构数据，进行分子对接并排序，并结合测试结果进行验证，确定方法的可靠性。后建立筛选规则和筛选模型，使用该规则和模型分别对小分子化合物数据库进行筛选、排序和打分，逐渐缩小范围，最终根据由上到下几次排序的结果，确定可以作为壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的化合物。

技术领域

本发明属于活性物质筛选技术领域，具体涉及一种壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的筛选方法。

背景技术

酶的特点是用量少、催化效率高、专一性强。酶制剂产业在经历了半个多世纪的迅猛发展后，现已经形成一个富有活力的高技术产业，在食品、纺织、洗涤、造纸、饲料和生物能源等行业都有广泛应用。目前，液体酶制剂技术相比同类产品生产制造过程节约用水约30％～50％、节能50％以上,更符合低碳经济的发展需要；毫无疑问，高活性、高纯度、液体酶将成为今后酶制剂的发展方向。

酶的活性功能决定于其分子结构的完整和严格的构象，环境因素的变化极易导致酶的空间结构破坏，从而丧失其原有的生物活性。一些小分子的物质，可以与酶活中心的氨基酸残基相互作用并进行锁定，对酶的构象进行空间限位，使酶进入休眠的状态。之后在某种激活条件下，小分子物质与酶活性中心的作用力变弱，从而解除下来，活性中心的功能基团重新获得自由伸展，酶的活性得到恢复，这是酶可逆抑制剂作用的基本原理。20世纪60年代初，Umezawa最早提出了酶抑制的概念，发展至今，主要用于药物筛选领域。

工业用酶可逆抑制剂没有现成的专一筛选模型和可参考的结构信息数据库，一直以来都是研究领域的难点问题，国内还未能有所突破。而在壳聚糖酶可逆抑制保护剂筛选技术领域还没有有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种壳聚糖水解酶的可逆抑制保护剂的筛选方法，筛选的可逆抑制保护剂可提高壳聚糖水解酶的稳定性；从而弥补现有技术存在的不足。

本发明首先建立已知的可逆抑制保护剂训练集，根据已有的壳聚糖水解酶结构数据，进行分子对接并排序，并结合测试结果进行验证，确定方法的可靠性。后建立筛选规则和筛选模型，使用该规则和模型分别对小分子化合物数据库进行筛选、排序和打分，逐渐缩小范围，最终根据由上到下几次排序的结果，确定可以作为壳聚糖水解酶可逆抑制保护剂的化合物，并进行进一步的实验验证。

本发明所提供的壳聚糖水解酶的可逆抑制保护剂的筛选方法，包括以下步骤：

1)根据已知于壳聚糖水解酶的结构数据，确定可逆抑制保护剂的类别及对壳聚糖水解酶的抑制常数，确定训练集的化合物；

2)将步骤1)所述的训练集中的化合物与壳聚糖水解酶进行分子对接，并使用步骤1)中的可逆抑制保护剂对壳聚糖水解酶活性的抑制常数进行修正；

3)根据步骤2)获得的训练集中的化合物与壳聚糖水解酶的结合自由能和可逆抑制常数，结合步骤1)训练集中的化合物筛选结果，制定筛选规则，建立筛选模型；

4)根据步骤3)制定的筛选规则和建立的筛选模型进行筛选。

进一步，所述的步骤1)进入训练集的组成化合物有2,4-二硝基苯甲醚(2,4-dinitro-1-fluorbenzene)，2-羟-5硝基苄溴(2-Hydroxy-5-nitrobenzyl bromide)，乙酸钠(Sodium acetate)，苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，乙酰亚胺酸乙酯(ethylacetimidate)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，葡糖胺(glucosamine)，盐酸胍(guanidiniumhydrochloride)，半胱氨酸(cysteine)，碘乙酸(monoiodoacetate)；这些化合物均是壳聚糖水解酶的抑制剂，包括可逆抑制剂和不可逆抑制剂，与蛋白的结合程度不同