[发明专利]一种香菇WD5140菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法

权利要求书

1.一种香菇WD5140菌种的InDel标记指纹图谱的构建方法，包括：

(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到PDA平板上，25℃下避光培养，10d后收集菌丝；

(2)基因组DNA的提取：用CTAB法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度为20～30ng/uL；CTAB法提取菌丝的基因组DNA工艺包括：

①取冷冻干燥后的香菇菌丝于2mL离心管中，并放入2-3颗钢珠；

②将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60Hz，时间30s研磨至均匀粉末；

③加入65℃预热1h的2×CTAB抽提液，于65℃保温60min，间隔20min轻摇混匀一次；

④12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装为两管各800μL；

⑤在上述上清液中加入体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；

⑥在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入另一离心管中；

⑦在上述离心管中加入相对于步骤⑥中上清液2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；

⑧将得到的沉淀加入1mL浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心5min；

⑨弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μL 10×TE缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解，加入1μL 10mg/mL的RNaseA于37℃水浴1h，去除RNA；

⑩将得到的DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

(3)InDel分子标记的检测：对上述提取的DNA进行开发的InDel标记的PCR扩增；

PCR扩增体系为：总体积20μL，包括：Premix Taq^TM(1.25U/25μL Taq DNA酶，0.4mM/LdNTP，0.3mM/L PCR buffer)10uL，10μmol/L InDel标记正向引物和反向引物总体积各1μL，浓度20～30ng/μL提取的模板DNA 2μL、ddH₂O 6μL；

PCR反应条件：94℃5min；94℃45second，55-60℃45second，72℃30second，35个循环；72℃7min；10℃保存；

(4)电泳检测：将上述PCR扩增得到的产物点样7μL于加入核酸染料的琼脂糖凝胶上进行电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.5％，电泳缓冲液为1×TAE，电压90v，电流300mA，功率100W，电泳5h，拍照，分析结果；

选用7对InDel标记引物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照DNA分子量对照D2000 bpDNA ladder可确定各InDel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为：000100(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇WD5140菌种；

其中7对InDel标记引物序列(5′-3′)如下：

Lefp_id001正向引物：ACGGATGGAGAGACACAGGA

反向引物：TGCCCCACTTACTCTCAACC

Lefp_id002正向引物：CCTTTCTCAAAAGCGGACTG

反向引物：GGGAGTGGGTTGTTTGGATA

Lefp_id003正向引物：CGGATGTTATGCACTGGAAG

反向引物：CGTACGGTTGGACATTTGAA

Lefp_id004正向引物：AGCCTTTCACAGTCAGCTCG

反向引物：GTCAACGGAGGGAAACAGAG

Lefp_id005正向引物：GTAGCACTCCTCATACAACC

反向引物：ACCAAATGTCACAGCACAGG

Lefp_id006正向引物：ACATTGGCGAAGGCTGTACG

反向引物：CCCTTTTGCCCTATAAGGCG

Lefp_id007正向引物：AACAGTAACCTGTGCACTGC

反向引物：CATGATCAGATCACACAGCG。