[发明专利]无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途

权利要求书

1.分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，其中：

(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(a1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；

(a2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1% Ⅱ型胶原酶振荡消化；

(a3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；

(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代增补培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO₂培养箱中培养；

(a5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80%以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代增补培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞，即P0代；

(b)传代培养脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：

(b1)按照5000/cm²密度接种原代即P0代间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂、37℃、饱和湿度条件，培养至细胞融合度达70~80%时，弃旧培养基，用D-hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D-hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞；

(b2)按照5000/cm²密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO₂培养箱中，于5% CO₂、37℃、饱和湿度条件，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞，

其中，

所述D-Hanks液的配方组成为：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.08g的Na₂HPO₄.12H₂O、0.35g的NaHCO₃、水至1000ml；

所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：1%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.12%硫代甘油、1%果糖；

所述传代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并且添加：2.5%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、15ng/ml的bFGF、0.04%硫代甘油、1%果糖。

2.根据权利要求1的方法，步骤(a2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作。

3.根据权利要求1的方法，步骤(a2)中，加入2倍体积的1% Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。

4.根据权利要求1的方法，步骤(a3)中，离心是以100xg离心5min的条件进行操作。

5.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1~5×10⁴/cm²接种至T75瓶。

6.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量2×10⁴/cm²接种至T75瓶。

7.根据权利要求1的方法，步骤(a4)中，CO₂培养箱中培养的条件为：5% CO₂，37℃，饱和湿度。