[发明专利]无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途

说明书

本发明涉及无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途。具体涉及分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，(b)阶段是将原代间充质干细胞接种，补充传代完全培养基培养，用D‑hanks液清洗，加重组胰酶溶液消化，得到P1代间充质干细胞；接着将P1代间充质干细胞接种参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞，继续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。本发明使用无血清培养基分离培养和传代培养脂肪间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，例如细胞收率高、细胞活率高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从脂肪中分离和传代脂肪间充质干细胞的方法。本发明还涉及上述脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液，还涉及无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途。使用本发明方法分离培养和传代培养所述脂肪间充质干细胞时，能够呈现本发明所述优异技术效果。特别是，本发明涉及使用无血清的培养基从脂肪中分离传代培养间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。

间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。

然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。