[发明专利]一种ω-转氨酶的应用及生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法

说明书

本发明公开了一种ω‑转氨酶的应用及生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法。所述ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该ω‑转氨酶具有催化D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸的活性，以D，L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括：用于将D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸的ω‑转氨酶，以及用于将2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L‑草铵膦的谷氨酸脱氢酶。本发明方法能够直接以D，L‑草铵膦为原料进行去消旋化，无需昂贵的拆分试剂；辅原料异丙醇可转化为副产物异丙胺，异丙胺可回收且是重要的农药化工原料，因此本发明工艺总体成本更低，具备工业化应用潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种ω-转氨酶的应用及生物酶法去消旋化制备L-草铵膦的方法。

背景技术

草铵膦(Glufosinate，也称为草丁膦phosphinothricin)，化学名：2-氨基-4(羟基甲基膦酰基)丁酸，是最早发现于几种链霉菌中的天然存在的非蛋白质氨基酸，并最早由德国赫斯特公司采用化学法合成并命名。草铵膦在分子结构上与谷氨酸非常相似，故其与谷氨酰胺合成酶的活性位点可发生可逆结合从而抑制谷氨酰胺合成酶的生物活性。谷氨酰胺合成酶是植物生产谷氨酰胺和氨解毒所必需的酶。草铵膦用于植物中能使谷氨酰胺水平下降，并使组织中氨的含量上升，这使得光合作用被抑制，从而使植物死亡。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍。L-草铵膦易于在土壤中降解，对作物较为安全，漂移小，除草谱广，毒性低，安全性高，具有较高活性，使得用量少，从而减小环境压力，并且杀草迅速，能除去或快速杀死马唐、黑麦草等100种以上的一年生或多年生的双子叶阔叶或禾本科杂草。可以用水作为溶剂，直接溶解使用，安全方便。草铵膦的药效只会在子叶内进行传导，不会转移到其他地方，而植物出土后，草铵膦不会通过根部发挥药效，由此其具有较小的药害性，而且使用过草铵膦的土壤并不会对随后播种的各类作物生长产生影响。随着百草枯退出市场，草甘膦抗性突出以及国内环保态势趋严，草铵膦作为全球第二大转基因作物耐受除草剂，其市场规模不断增长。由此可见，对草铵膦的开发利用显得非常重要。

目前合成L-草铵膦的主要方法有化学法和生物法。化学法合成L-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。相比之下，生物法合成草铵膦立体选择性严格、收率高、反应条件温和、产物易分离纯化，研究生物法生产L-草铵膦具有十分重要的产业化价值和显著的社会效益。

现有生物法合成L-草铵膦主要包括以下3大类：1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得；2)以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶的不对称合成获得；3)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。目前工业上生产D，L-草铵膦的技术已经十分成熟，通过酶法去消旋化外消旋产物能直接对接现有生产体系，具有重要的市场前景和社会价值。

比如，中国专利CN105567780A同样以D，L-草铵膦为原料，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦脱氢为2-亚胺基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，然后用钯碳-甲酸铵化学催化为L-草铵膦。中国专利CN107502647A以D，L-草铵膦为原料，先是利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，再通过氨基酸脱氢酶将其催化还原为L-草铵膦，进而实现了D，L-草铵膦的原位去消旋化。但是D-氨基酸氧化酶在反应过程中会产生过氧化氢，易导致酶蛋白的失活；虽然可以通过添加额外的过氧化氢酶去除过氧化氢，但实际并不能完全消除过氧化氢的不利影响，而且过氧化氢酶的使用会增加过程成本。

美国专利US20180030487采用两步法将D，L-草铵膦去消旋化生成L-草铵膦，先用D-氨基酸氧化酶或D-氨基酸脱氢酶或化学法将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸，再通过转氨酶或L-氨基酸脱氢酶或化学法将2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸还原为L-草铵膦，但D-氨基酸脱氢酶种类稀少、酶活低，且需要消耗等当量的昂贵辅酶NADPH，不具备工业化潜力。