[发明专利]一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrep^TM Multisource Genomic DNA完成；

（2）引物的设计与合成：根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1-F：5′-GCCCCGGTACGTATAGTGTG-3′；下游引物为VP1-R：5′-CCCGTACATGTGGTCTGCAT-3′；引物使用前，用超纯水溶解，使用浓度为10pmol，-20℃保存备用；

（3）绝对荧光定量PCR方法的建立：通过使用TaKaRa公司的TB Green™ Premix Ex Taq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL；加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理；反应程序如下：先95 ℃预变性30s，然后95 ℃变性5s，最后60 ℃退火34s，反应程序共40个循环；

（4）标准曲线的绘制：将实验室已经成功制备的pcDNA3.1-VP1质粒作为阳性标准品备用；将阳性标准品质粒换算拷贝数后，进行连续的10倍倍比稀释，从1∶10到1∶10 ⁹ 共设置9个浓度梯度，每个梯度设置3个重复，于ABI 7500型荧光定量PCR仪中进行扩增，同时设置去离子水为阴性对照；扩增结束后收集数据，根据扩增曲线图、CT值情况，得出最佳的检测区域，并绘制标准曲线；

（5）绝对荧光定量PCR方法的灵敏度和特异性试验：通过标准曲线的绘制显示可检测到仅含10个病毒DNA拷贝数的鸡传染性贫血病病毒，体现出绝对荧光定量PCR方法的灵敏度；将实验室已有的禽腺病毒FAdV、禽白血病病毒ALV和网状内皮组织增生症病毒REV提取相应核酸，按照扩增体系运行程序；同时设鸡传染性贫血病病毒阳性对照及去离子水的阴性对照，检测结果体现出绝对荧光定量PCR方法的特异性。