[发明专利]一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，科学地设计特异扩增鸡传染性贫血病病毒病毒VP1基因片段的引物，然后通过使用TaKaRa公司的TB Green™Premix Ex Taq™II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立。根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，科学设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1‑F：5′‑GCCCCGGTACGTATAGTGTG‑3′；下游引物为VP1‑R：5′‑CCCGTACATGTGGTCTGCAT‑3′；本发明可用于企业对鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒的快速且特异的检测；可通过定量检测鸡传染性贫血病病毒含量情况，从而了解鸡传染性贫血病病毒在体内的变化规律等，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策略提供了有效手段。

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

鸡传染性贫血病病毒（Chicken Infectious Anemia Virus，CIAV）感染主要引起雏鸡障碍性贫血及全身性淋巴组织萎缩；成年鸡感染鸡传染性贫血病病毒后常呈亚临床带毒，导致生产性能以及免疫功能下降。鸡传染性贫血病病毒既能水平传播，又能垂直传播。自1979年首次报道以来，鸡传染性贫血病病毒已蔓延至世界各地。我国于1992年首次在黑龙江省分离到鸡传染性贫血病病毒，随后在河南、山东、江苏、辽宁、吉林等地的鸡群中也陆续分离到鸡传染性贫血病病毒。近年来，由于我国养鸡业的规模化、集约化发展，且缺乏有效的防控策略，该病在我国流行范围不断扩大，给养鸡业带来了严重的经济损失。现阶段，在临床上常用血清学检测方法（病毒中和试验、间接荧光抗体试验、ELISA 试验等）对疑似感染鸡传染性贫血病病毒的病例进行确诊。随着检测技术的不断进步，核酸探针技术、PCR技术、实时荧光定量PCR技术等逐步应用于鸡传染性贫血病病毒的特异性检测。现阶段，生产实践中鸡传染性贫血病病毒疫苗污染残留及临床样品中低含量鸡传染性贫血病病毒检测准确度较低，也缺少较为敏感且特异对鸡传染性贫血病病毒定量检测的方法。因此，本发明有利于完善鸡传染性贫血病病毒的检测方法，为进一步探究鸡传染性贫血病病毒的分子生物学特征及制定有效防控策略提供了一种技术支持。

发明内容

本发明的目的在于针对现有问题的不足，提供了一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法。

本发明的技术方案是：一种鸡传染性贫血病病毒绝对荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取：鸡传染性贫血病病毒基因组DNA的提取通过使用Axygen公司的DNA小提试剂盒AxyPrep^TM Multisource Genomic DNA完成；

（2）引物的设计与合成：根据鸡传染性贫血病病毒VP1基因的高度保守区，设计并合成了扩增片段大小为140bp的上下游引物，引物序列如下：上游引物为VP1-F：5′-GCCCCGGTACGTATAGTGTG-3′；下游引物为VP1-R：5′-CCCGTACATGTGGTCTGCAT-3′；引物使用前，用超纯水溶解，使用浓度为10pmol，-20℃保存备用；

（3）绝对荧光定量PCR方法的建立：通过使用TaKaRa公司的TB Green™ Premix ExTaq™ II试剂来进行绝对荧光定量PCR方法的建立，反应体系为20μL：A液：模板2μL，双蒸水6μL；B液：TB Green Premix Ex Taq II（2×）10μL，上下游引物各0.8μL，ROX ReferenceDyeⅡ（50×）0.4μL；加样时先在八联管反应管里加入B液，后加A液，上机前离心处理；反应程序如下：先95℃预变性30s，然后95℃变性5s，最后60℃退火34s；反应程序共40个循环；