[发明专利]一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法

权利要求书

1.一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）克隆金花茶CnFLS基因，合成烟草反义表达F3’H基因的干扰序列；

2）构建CnFLS+反义F3’H双基因载体；

3）将CnFLS+反义F3’H双基因载体转入大肠杆菌，测序正确后，提取质粒转入农杆菌中，采用农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟草；

4）采用PCR鉴定转基因烟草阳性株系，利用HPLC方法测定阳性株系花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分含量，并计算黄酮总量、多酚总量、花青素苷总量。

2.如权利要求1所述的一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中克隆CnFLS基因具体为：根据金花茶的CnFLS基因序列设计引物pFLS-F和pFLS-R，使用ExTaq酶进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，所述pFLS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，pFLS-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述PCR扩增反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min。

3.如权利要求1所述的一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中合成干扰序列具体为：根据烟草F3’H基因的序列，设计并合成反义F3’H基因干扰序列，所述反义表达F3’H基因的干扰序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.如权利要求1所述的一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤2）具体为：将步骤1）得到的CnFLS基因、反义F3’H基因干扰序列分别构建至带有酶切位点的pBWA(V)和pBWD(LA)载体中，得到pBWA(V)KS-FLS、pBWD(LA)1C-antiF3’H中间载体，利用OSCR克隆技术进行酶切连接，回收产物得到CnFLS+反义F3’H双基因载体。

5.如权利要求4所述的一种金花茶CnFLS+反义F3’H双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述酶切体系为：Buffer: 2µL，BsmBI/Esp3I: 1µL，T4_ligase: 1µL，pBWA(V)KS-FLS: 4µL，pBWD(LA)1C-antiF3’H: 4µL，H₂O: 8µL，Total:20µL，所述酶切连接反应程序为：37℃ 20 min；37℃ 10 min，20℃ 10min，5个循环；37℃ 20 min；80℃ 5min。