[发明专利]一种CRISPR系统及其在高山被孢霉中的应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR系统及其在高山被孢霉中的应用，属于生物工程技术领域技术领域。本发明采用的核酸酶为毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的LbCpf1，所使用的诱导型启动子为里氏木霉(Trichoderma reesei)中的cbh1，所选靶向基因为尿嘧啶基因ura5，所用的出发菌株为高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型MAU1，本发明提供的基于CRISPR技术的高山被孢霉系统，可实现生物量和产脂含量与野生菌无显著性差异，并可以实现多基因表达，此方法将为构建高工业价值的重组高山被孢霉提供技术手段。

技术领域

本发明涉及一种CRISPR系统及其在高山被孢霉中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

高山被孢霉是一株具有工业价值的高产花生四烯酸的产油丝状真菌。目前，高山被孢霉的产脂途径已基本明晰，其体内的多个产脂相关基因的功能已被成功验证。为进一步构建高产菌株，研究者需要借助多基因表达手段，将已验证功能的产脂关键基因导入到高山被孢霉基因组中。目前，高山被孢霉中进行基因表达局限在两个基因层面。受转化方法及筛选标记的局限，传统的共转化法、多操纵子法等无法应用于高山被孢霉。传统的筛选标记回收法包括Cre/LoxP以及FLP/FRT，这两个系统会出现由于多个识别位点遗留而导致宿主菌正常基因功能缺失或者死亡的问题。如何根据高山被孢霉自身的遗传背景以及现存的技术手段解决多基因表达是后续构建高产菌株首先需要解决的技术难题。

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统是近几年兴起的靶向基因敲除技术。此系统主要包括核酸酶和引导链两部分，其发挥功能的主要原理为靶向引导链引导核酸酶对靶向基因进行DNA双链的切割。此技术自被发明以来，已被广泛应用于多种生物中。借助诱导型启动子，将CRISPR系统设计为靶向敲除筛选标记的筛选标记回收系统，可以在高山被孢霉中实现凭借单个筛选标记进行多基因表达的目的。

CRISPR中应用较多的核酸酶包括Cas9和Cpf1两种。对比Cas9，Cpf1具有一系列优势，例如引导链不需要反式激活的CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA)，可以剪切DNA和RNA，Cpf1剪切双链DNA产生粘性末端等。目前，应用比较广泛的Cpf1包括三种，分别来源于氨基酸球菌属Acidaminococcus sp.、毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium(LbCpf1)和弗朗西丝氏菌Francisella novicida，但现有技术中丝状真菌利用CRISPR系统敲除基因的效率相对不高，且没有针对高山被孢霉的CRISPR敲除系统。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为丝状真菌高山被孢霉提供一种基于CRISPR技术的基因敲除方法及多基因表达技术。

本发明的第一个目的是提供一种核酸酶LbCpf1编码基因，其含有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明的第二个目的是提供含有所述核酸酶LbCpf1编码基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。

在一种实施方式中，所述诱导型表达载体含有诱导型启动子Pcbh1。

在一种实施方式中，所述诱导型启动子Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述表达载体，或基因组上整合有SEQ ID NO.1所示核酸酶LbCpf1编码基因的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以高山被孢霉为宿主。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是可用于尿嘧啶靶向敲除的重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1。