[发明专利]检测紫外照射后微生物基因组损伤的方法

说明书

本发明提供一种检测紫外照射后微生物基因组损伤的方法，包括步骤：获取培养后的微生物，取部分微生物进行不同时长的紫外照射，照射后作为检测样本，未进行紫外照射的另一部分微生物作为对照样本；裂解所述检测样本和所述对照样本；分别对裂解后的所述检测样本和所述对照样本离心处理，获得上清，作为荧光定量PCR的模板；取等量作为模板的上清分别加入两个PCR反应体系中，一个扩增短片段，另一个扩增长片段；得到所述对照样本的CT差值为：ΔCT_CK＝CT_长‑CT_短，所述检测样本的CT差值为：ΔCT_uv＝CT_长‑CT_短，采用ΔΔCT＝ΔCT_uv‑ΔCT_CK判断紫外对DNA的损伤。本发明的检测方法无需凝胶电泳和成像等多步复杂操作，整个实验流程，操作简单，检测的灵敏度高。

技术领域

本发明涉及紫外照射微生物检测技术领域，特别涉及一种利用荧光定量PCR技术来检测紫外照射后微生物基因组损伤的方法。

背景技术

紫外线(UV)照射能使DNA分子中同一条链相邻胸腺嘧啶碱基形成以共价键连接成环丁烷结构的二聚体，影响DNA的双螺旋结构，使其复制和转录功能受阻，最终对环境中的有害微生物起到灭活的作用。因此提供一种快速检验紫外照射后微生物基因组损伤的方法来对环境中的微生物的紫外照射后DNA损伤进行准确和快速的检测具有十分重要的意义。

目前以彗星实验为代表的DNA损伤检测技术，主要用来检测真核细胞的DNA损伤，且操作复杂，工作量较大。现有检测技术的检测时间均较长，都无法在短时间完成DNA损伤的快速检测要求。

不仅如此，目前还没有报道紫外线照射后基因组损伤的检测方法。现有的彗星电泳检测法虽然已经比较精简，但是整个测试流程包括：凝胶板的制备-细胞裂解-DNA碱解旋-电泳-中和-脱水-染色以及图像采集等步骤，操作复杂，要求较高的实验技能。且实验用的染料多为溴化乙锭，是一种对操作人员健康造成威胁的强诱变剂。同时这种检测方法主要用于真核细胞，对原核细胞DNA损伤的检测较少。

发明内容

本发明的目的在于解决背景技术中的至少一个技术问题，提供一种快速检测紫外照射后微生物基因组损伤的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种检测紫外照射后微生物基因组损伤的方法，包括以下步骤：

获取培养后的微生物，取部分微生物进行不同时长的紫外照射，照射后作为检测样本，未进行紫外照射的另一部分微生物作为对照样本；

裂解所述检测样本和所述对照样本；

分别对裂解后的所述检测样本和所述对照样本离心处理，获得上清，作为荧光定量PCR的模板；

将作为模板的上清加入两个PCR反应体系中，一个扩增短片段，另一个扩增长片段；

得到所述对照样本的CT差值为：ΔCT_CK＝CT_长-CT_短，所述检测样本的CT差值为：ΔCT_uv＝CT_长-CT_短，采用ΔΔCT＝ΔCT_uv-ΔCT_CK判断紫外对DNA的损伤。

根据本发明的一个方面，获得检测方法的检测限为所述对照样本标准偏差的3倍；

所述对照样本标准偏差为按照裂解，离心获得上清，以及将上清加入两个PCR反应体系中扩增短片段和长片段的步骤对所述对照样本进行20次相同的荧光定量PCR反应后得到。

根据本发明的一个方面，采用裂解液A裂解所述检测样本和所述对照样本，裂解时间为2分钟；

所述裂解液A的组成包括：

PH＝8.0的Tris-HCL 10mM