[发明专利]乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用

权利要求书

1.一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法，其特征在于，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过如下方法获知患者的基因突变位点：对乙型血友病患者来源的iPS细胞，提取该iPS细胞基因组DNA，利用如下引物序列对外显子序列进行PCR扩增并测序：

引物1：正向引物：CCACTGCCCATTCTCTTCA；

反向引物：TACTTACCAACCTGCGTGCT；

引物2：正向引物：CATGCCCTAAAGAGAAATTGG；

反向引物：TGGGTTAGAGGGTTGGACTG；

引物3： 正向引物：TCAGGAAGACAGGAGCATCA

反向引物: GAGGGAAACTTTGAACCATGAG;

引物4： 正向引物：ACCCATACATGAGTCAGTAGTTCC；

反向引物：GACACAGAAAGAATTCAGGTTGTAG；

引物5： 正向引物：AATACTGATGGGCCTGCTTC；

反向引物：ACCTGGCCTGTGTCTTGC；

引物6： 正向引物：GCCTATTCCTGTAACCAGCAC；

反向引物：GACCCTTCTGCCTTTAGCC；

引物7：正向引物：CAATTAGGTCAGTGGTCCCAAG；

反向引物：GGGAAAGTGATTAGTTAGTGAGAGG；

测序结果用DNAMAN软件分析，找到基因突变位置。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正的方法为：根据测序结果，设计CRISPR/sgRNA，通过错配检测的方式在HEK293T细胞上验证sgRNA对目标位点的切割能力，选择剪切效率高的sgRNA用于后续基因矫正实验，选用PX459作为CRISPR/Cas9质粒，构建CRISPR/sgRNA载体；设计单链同源模板，通过电击转染进行基因矫正，并用嘌呤霉素筛选富集阳性克隆。

4.根据权利要求3所的方法，其特征在于，所述单链同源模板中引入同义突变，且引入点在前间区序列邻近基序结构5’端附近。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，成功获得矫正的iPS细胞通过如下培养方案进行肝系分化：

第1天使用如下培养基进行培养：包含0.5-2%（v/v）的B27（不含维生素A）、50-70 ng/ml活化素A、1-3μM CHIR99021 的RPMI 1640培养基；

第2-3天使用如下培养基进行培养：包含50-70 ng/ml活化素A的PRMI 1640培养基，每日更换培养基；

在第3-8天使用如下培养基进行培养：含1-3%（v/v）B27（含维生素）A、BMP4 10-30 ng/ml、bFGF 5-15 ng/ml的RPMI 1640培养基，每日更换培养基；

在第8- 13天使用如下培养基进行培养：含1-3%（v/v）的B27（含维生素A）、10-30ng/mlHGF的RPMI 1640培养基，每日更换培养基；

第13-18天使用如下培养基进行培养：含有0.02-0.08 mg/ml转铁蛋白、0.1~0.3mg/ml胰岛素、0.02~0.06 μg/ml硒酸、10-30ng/ml OSM、0.3-0.8μM Dex的IMDM培养基，隔日更换培养基，

其中，上述培养基均先覆盖一层Matrigel基质胶。