[发明专利]乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用

说明书

本发明公开一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞，该细胞可在体内外表达正常的具有功能的F IX因子，实现乙型血友病的个性化基因和细胞治疗，可以大大节省治疗成本，同时避免了中和性抗体，病毒感染和血友性关节炎等相关疾病的产生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙型血友病患者来源的诱导多能干细胞的基因矫正及肝系分化方法及其应用。

背景技术

乙型血友病是凝血因子IX缺乏引起的一种遗传性出血性疾病，约占全部血友病病人的15％左右。乙型血友病发病机制主要是由于F IX基因发生点突变、框架移位、缺失、插入等，导致F IX蛋白质结构或功能异常，从而出现凝血障碍。人F IX基因位于X染色体，全长3.4kb，由8个外显子和7个内含子以及侧翼序列组成。成熟的人类F IX由415个氨基酸残基组成，分子量为57000，其中约20％为糖类。在肝细胞内合成，由一个γ-羧基谷氨酸区(Gla)，两个类似表皮生长因子(EGF)区，一个激活肽(AP)区和一个催化区构成。在F IX修饰分泌过程中，会释放28个氨基酸的信号肽和18个氨基酸的前肽。当被激活的时候，F IX会在精氨酸145-丙氨酸146肽键和精氨酸180-缬氨酸181肽键2个位点先后发生裂解，释放35个氨基酸激活肽，从而形成重链-轻链结构的功能F IX。

目前乙型血友病的治疗方法主要是外源凝血因子替代法，即采用新鲜冰冻血浆、血浆冷沉淀物、重组凝血因子等补充缺失的F IX。但是这种方法不仅成本高，而且可能引起中和性抗体，病毒感染和血友性关节炎等相关疾病，一定程度上又加重了患者的疾病负担。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种制备乙型血友病患者自体诱导多能干细胞的方法，利用乙型血友病病人来源的iPS细胞(诱导性多能干细胞)，针对病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞，该细胞可在体内外表达正常的具有功能的F IX因子，实现乙型血友病的个性化基因和细胞治疗。

为实现上述目的，本发明提出了一种制备乙型血友病患者自体诱导多能干细胞的方法，针对乙型血友病病人的基因突变位点，利用CRISPR/Cas9系统进行定点基因矫正，筛选成功获得矫正的iPS细胞定向扩增分化为肝细胞。

其中，通过如下方法检测患者的基因突变位点：对乙型血友病患者来源的iPS细胞，提取该iPS细胞基因组DNA，利用如下引物序列对外显子序列进行PCR扩增并测序：

引物1：正向引物：CCACTGCCCATTCTCTTCA；

反向引物：TACTTACCAACCTGCGTGCT；

引物2：正向引物：CATGCCCTAAAGAGAAATTGG；

反向引物：TGGGTTAGAGGGTTGGACTG；

引物3：正向引物：TCAGGAAGACAGGAGCATCA

反向引物:GAGGGAAACTTTGAACCATGAG；

引物4：正向引物：ACCCATACATGAGTCAGTAGTTCC；

反向引物：GACACAGAAAGAATTCAGGTTGTAG；

引物5：正向引物：AATACTGATGGGCCTGCTTC；

反向引物：ACCTGGCCTGTGTCTTGC；

引物6：正向引物：GCCTATTCCTGTAACCAGCAC；

反向引物：GACCCTTCTGCCTTTAGCC；