[发明专利]一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法

权利要求书

1.一种番茄斑萎属病毒的核酸标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选择番茄斑萎属病毒的基因保守区域序列为扩增靶区，如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述基因为TSWV复制酶基因中的一段序列；

2)设计合成对该基因选定区域的上下游引物；

3)获取复制酶基因DNA片段，所述基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；

4)经鉴定后获得的重组菌株进行大量培养，提取pGEM-R质粒DNA；

5)将获得的质粒DNA进行BsaI酶切线性化，用Promega反转录试剂盒进行反转录获得RNA序列，序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；

6)纯化获得的RNA分子，并加入DNase消化模板DNA，最后用无RNA酶的灭菌水稀释定量RNA；

7)定量RNA浓度及拷贝数，将最终纯化产物进行稀释定量后，分装于EP管中，-80℃保存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，复制酶基因DNA片段，具体过程如下：

提取病毒粒子的RNA序列或者病毒侵染的植物样本组织，用随机引物做反转录，获得cDNA序列，再用设计的复制酶基因特异性引物扩增目标片段，所述一对特异性引物为：

RdRp-F:5’-GCAACTAACGCCACACCTGAC-3’

RdRp-R:5’-GGTCTCGTAACAAGTGAATCAATTATTCTTTC-3’；

预期扩增产物为TSWV的复制酶基因的566bp，并用SacII/SpeI双酶切后回收纯化。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，定量RNA浓度及拷贝数具体步骤为，取纯化后的体外转录物RNA分子，用不含RNase的灭菌水进行梯度稀释，10、20、30、40、50和100倍，测定不同浓度样品的OD260和OD280，根据目标序列的核苷酸长度，经过计算，最终获得RNA分子在单位体积内的数量，用pmol表示。