[发明专利]一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法

说明书

一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法。本发明所涉及的病毒核酸标准物质由如下步骤制得：选择基因保守区为扩增靶标区；设计引物并合成；序列扩增；构建表达载体；体外转录；浓度测定并稀释；分装；检测定量。利用本发明制备的标准物质具有稳定性，无生物传染性，适应范围广等特性，可利用反转录PCR以及荧光定量PCR在番茄斑萎属病毒的检测标准物质。

技术领域

本申请涉及核酸标准物质领域，具体而言，涉及本发明涉及一种番茄斑萎属病毒核酸标准物质的制备方法。

背景技术

分子生物学检测是病毒检测中必不可少的组成部分，然而检测的阳性质控却是难以获得，对方法的验证和检测的开展都极为不利。目前植物病毒的标准样品主要通过从国际权威或著名生物标准品中心进行购买；与在研究刊物上发表研究文献的实验室联系索取而获得；购买商业试剂盒所配备的阳性对照。这些标准品都是血清学方法的对照，本地扩繁和保存难度大，存在运输周期长，费用高、保存难等问题，加上检疫性植物病毒进口手续繁琐，因此获得和收集病毒的阳性质控极为困难。

番茄斑萎病毒属是一类值得关注的植物病毒。病毒种类或分离物不断增加，寄主范围也在不断扩大，仅TSWV就能侵染1090种植物，涉及到番茄、辣椒、莴苣等蔬菜作物，花生、豌豆、烟草等重要经济作物及菊花、马蹄莲等许多花卉作物。该属病毒分布于亚洲和美洲大部分地区。造成的危害轻者减产，重者绝收，引起的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。番茄斑萎病毒属是近年来对我国蔬菜水果等生产危害上升的一类病毒，这类病毒也是国际上植物检疫比较重视的病毒。这类病毒种类繁多，基因组数据缺乏，亲缘关系复杂，对检测方法的准确性提出了极高的要求，这就需要检测实验室储备有检测用的阳性质控。

本项目将通过体外转录的方式获得可用作分子生物学检测阳性质控RNA，旨在研究确定这类阳性质控的保存方式、保存条件和运输要求等，为今后病毒分子检测阳性质控的制备进行基础数据的储备，也为促进这一类病毒的检测提供有效准确的阳性质控。同时由于这类阳性质控丧失侵染活性，也降低了有害生物引进带来的风险。

发明内容

为了填补目前产品的空白和满足植物检验检疫的需要，本发明旨在开发能够适用于番茄斑萎属病毒主要病毒分子生物学检测的阳性质控。该物质具有稳定性，无生物传染性。

一种番茄斑萎属病毒的核酸标准物质的制备方法，其特征在于包括以下技术步骤:

步骤1.选择番茄斑萎属病毒的基因保守区域序列为扩增靶区。如序列表中SEQ IDN0.1所示，所述基因为TSWV复制酶基因中的一段序列；

步骤2.设计合成对该基因选定区域的上下游引物；

步骤3.获取复制酶基因DNA片段，具体过程如下:

提取病毒粒子的RNA序列或者病毒侵染的植物样本组织，用随机引物做反转录，获得cDNA序列，再用设计的复制酶基因特异性引物扩增目标片段，所述一对特异性引物RdRp-F:5’-GCAACTAACGCCACACCTGAC-3’和RdRp-R:5’-GGTCTCGTAACAAGTGAATCAATTATTCTTTC-3’；预期扩增产物为TSWV的复制酶基因的566bp，并用SacII/SpeI双酶切后回收纯化。

SacII/SpeI双酶切pGEM-T载体，并将复制酶基因融合后连接到载体上，经转化大肠杆菌，最终得到pGEM-R载体；所述基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。

步骤4.经鉴定后获得的重组菌株进行大量培养，提取pGEM-R质粒DNA。

步骤5.将获得的质粒DNA进行BsaI酶切线性化，用Promega反转录试剂盒进行反转录获得RNA序列。序列如序列表中SEQ ID N0.2所示。

步骤6.纯化获得的RNA分子，并加入DNase消化模板DNA，最后用无RNA酶的灭菌水稀释定量RNA。